Page 120 - 《精细化工》2021年第5期
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·974· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷
Kumquat NEPP (100 mg/L) showed no toxicity to RAW 264.7 macrophage cells, increased NO secretion
and boomed phagocytic activity.
Key words: Kumquat; non-extractable polyphenol; response surface method; RAW 264.7 macrophage cells;
immunomodulatory activity; modernization technology of traditional Chinese technology
金柑，又名金橘、金桔、金弹等，是湖南省浏 先用有机溶剂提取浏阳金柑中的 EPP，然后以所得
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阳市主要的特色农作物，是常见的药食兼用型水果 ， 果渣为原料，采用 PEF 法提取其中的 NEPP 并应用
具有抗氧化、抑菌、抗癌、调节免疫力、降脂及防 响应面设计确定最佳的提取工艺，之后选用 RAW
[2]
治心脑血管疾病等多种功效 。多酚是植物次生代 264.7 巨噬细胞模型研究金柑 NEPP 的免疫活性，为
[3]
谢产物 ，根据其与细胞壁的结合与否，将植物多 金柑的综合开发与利用提供新的思路和参考。
酚分为游离多酚（EPP）和结合多酚（NEPP）两大
1 实验部分
类，其中 NEPP 通过化学键与细胞壁结合，需要通
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过酸或碱水解等作用断裂化学键，再进行提取分离 。 1.1 原料、试剂与仪器
近年来，植物多酚备受关注，大量研究表明， 福林酚试剂（1 mol/L）、没食子酸标准品、噻
多酚抗炎机制可通过抗氧化应激途径打断氧化应激 唑蓝（MTT）、LPS，美国 Sigma 公司；甲醇、丙酮、
反应，减少炎症因子释放 [5-6] ，具有免疫调节作用 [7-8] 。 乙酸乙酯、无水碳酸钠，分析纯，广州化学试剂厂；
但目前对植物多酚的研究主要集中在 EPP，文献中 所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。RAW 264.7
有关总酚含量的概念也常常是指游离部分，而忽略 巨噬细胞，中国科学院干细胞库；改良杜氏伊格尔
了 NEPP [9-10] 及其抗炎作用。HAN 等 [11] 对蔓越莓 （DMEM）高糖培养基、PBS 缓冲液（pH 7.4）、青-
NEPP 抗炎活性的分子机制进行了研究，发现 NEPP 链霉素双抗，美国 Gibco 公司；胎牛血清，杭州四
处理脂多糖（LPS）诱导的 RAW 264.7 巨噬细胞后， 季青生物工程材料有限公司；中性红，美国 Solarbio
显著抑制 iNOS（Inducible nitric oxide synthase）炎 公司；一氧化氮（NO）试剂盒，上海碧云天生物技
症因子的表达，发挥抗炎作用；增加 HO-1(Heme 术有限公司。完全培养基：在 450 mL DMEM 中添
oxygenase-1)抗氧化酶表达，从而提高细胞抗氧化能 加 50 mL 胎牛血清和 100 μL 青-链霉素双抗。
力；通过降低 IkB-α（I-Kappa-B inhibitor alpha）和 KQ-500DE 型数控型超声波清洗器，昆山超声
p50（Phosphorylation 50）的磷酸化水平，抑制 NF-kB 仪器有限公司；TE-FD-1L 型冷冻干燥机，上海拓纷
（Nuclear factor-k-gene binding）信号通路的激活与 机械有限公司；R204B3 型旋转蒸发仪，上海申顺生
表达。LOU 等 [12] 和 BARRECA 等 [13] 研究表明，金柑 物科技有限公司；ML204 型电子天平，上海梅特勒-
NEPP 中的主要成分为黄酮类物质；ROOWI 等 [14] 托利多仪器有限公司；WB-2000 型恒温水浴锅，郑
和 LOU 等 [15] 列举了金柑中含量较高的黄酮类物质， 州长城科工贸有限公司；H2050R 型离心机，湖南湘
例如：根皮素-3′，5′-二-C-β-葡萄糖苷、野漆树苷、 仪实验仪器开发有限公司；TC-2323 型 CO 2 培养箱，
5-去甲二氢川陈皮素、牡荆素-2-O-鼠李糖苷、柚皮 美国 Sheldon 公司；EnSpir 多功能酶标仪，珀金埃
苷、橙皮苷、新橙皮苷等，这些物质具有抗氧化、 尔默仪器有限公司；CKX41 型倒置生物显微镜，
抗菌、抗肿瘤和抗代谢紊乱作用，且 NEPP 在摄入 Olympus 公司；Ac2-4s1 型生物安全柜，新加坡艺思
后，咀嚼、胃酸、消化酶的作用都不会将 NEPP 明 高科技有限公司。
显地从食物基质中释放出来，它们几乎可以完整地 1.2 方法
到达结肠，被结肠微生物群所转化 [16] ，其代谢产物 1.2.1 NEPP 提取方法
可能发挥更有效的抗炎、抗氧化作用。 参考文献[15]方法将金柑切片后，真空冷冻干
脉冲电场提取法（PEF）是一种新兴的提取方 燥处理，称重、粉碎，于–20 ℃保存；取 50 g 金柑
法，其作用机理是利用细胞膜电穿孔原理在瞬间使 冻干粉按液料比 30∶1（mL∶g）加入丙酮水溶液混
细胞破壁，造成细胞膜电位混乱，细胞壁和细胞膜 合，在 210 W 的超声功率下用体积分数 80%丙酮水溶
发生可逆或不可逆的破坏，使细胞组分流出。与本 液提取 38 min。将混合物离心（5000 r/min，10 min）
课题组之前的研究中采用碱处理法提取金柑果渣中 后，取果渣用蒸馏水洗净残留的丙酮后冷冻干燥。
的结合多酚不同的是，PEF 法可以避免样品中的活 称取 5 g 冻干后的果渣，按一定比例与水混合，
性成分被破坏，提高结合多酚纯度，且具有操作简 调节脉冲电场两电极板间电压、脉冲数进行提取，
单、高效节能、处理时间短等优点 [17] 。本研究中， 之后将混合物离心（5000 r/min，10 min）后取上清
