Page 121 - 《精细化工》2021年第5期

第 5 期 朱雅雯，等: 金柑结合多酚的制备及其对 RAW 264.7 巨噬细胞免疫调节活性 ·975·

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液，对所得上清液进行多酚含量检测。由于上清液 长期的巨噬细胞，每孔细胞浓度为 1×10 个/L，在 96
中溶剂含量较多，为了方便后续实验，将上清液倒 孔板中每孔加入 100 µL 细胞悬液进行铺板，边缘孔
入乙酸乙酯中萃取，萃取后含 NEPP 相，经低温冷 用 PBS 填充。然后在体积分数 5% CO 2 、37 ℃CO 2
冻分离使乙酸乙酯挥发，得到 NEPP 固体。 恒温培养箱中培养 24 h，吸除上清液，加入含不同
1.2.2 单因素实验 质量浓度样品的完全培养基 200 µL，设置 5~7 个质
设置影响因素为高压脉冲电场场强（8.0、8.5、 量浓度梯度，每个梯度设置 5 个重复孔。作用 24 h
9.0、10.0、10.5、11.0、12.0 kV/cm）、电场脉冲数 后，吸除上清液，加入 100 µL 质量浓度 0.5 g/L 的
（50、100、150、200、250、300、350、450、500 MTT 溶液，在 CO 2 培养箱中孵育 2 h 后，吸除上清
次）、液料比〔1.00∶1、0.50∶1、0.40∶1、0.35∶1、 液；每孔中加入 100 µL DMSO，置于微量振荡器上
0.30∶1、0.25∶1、0.20∶1（L∶g）〕，当场强为变 振荡 10 min，使结晶完全溶解。然后用多功能酶标
量时，脉冲数为 250 次，液料比为 0.30∶1(L∶g)； 仪于 570 nm 处测量各孔的吸光度。注意同时设置调
当脉冲数为变量时，场强为 10 kV/cm，液料比为 零孔和对照孔。最后算出 NEPP 对 RAW 264.7 细胞
0.3∶1(L/g)；当液料比为变量时，脉冲数为 250 次， 的存活率（Y）。
场强为 10 kV/cm。分别测定各因素不同水平对金柑 A  A
NEPP 含量的影响。 Y /%  s b ×100 （1）
A  A b
c
1.2.3 金柑 NEPP 含量测定 式中：A s —实验组吸光度（含细胞、培养基、样品、
参照 ZOU 等 [18] 的方法并做适当修改。准确称
MTT）；A c —对照组吸光度（含细胞、培养基、MTT、
取 2.5 mg 没食子酸标准品，用水溶解后定容于 25
无样品）；A b —空白组吸光度（含细胞、MTT、无培
mL 容量瓶中，吸取没食子酸标准品溶液（0、0.1、
养基、无样品）。
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL）于 10 mL 容量瓶中，
1.2.5.2 Griess 法检测金柑 NEPP 对细胞 NO 释放的
在容量瓶中加入 0.5 mL 浓度为 1 mol/L 福林酚试剂，
影响
室温下反应 10 min 后，加入 1.5 mL 质量分数 20%
按照文献[25]方法并做适当调整，将处于对数
的 Na 2 CO 3 水溶液，避光反应 1 h 后定容，测定波长
765 nm 处溶液的吸光度，得到没食子酸标准曲线为 生长期的巨噬细胞用刮刀轻轻刮下，吹打均匀后，
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y= 54.386x+0.002（R =0.9991），其中 x 为没食子酸 每孔细胞浓度为 1×10 个/L，按每孔 100 µL 接种于
质量浓度，g/L；y 为没食子酸溶液的吸光度。NEPP 96 孔板中，于培养箱中培养 24 h，使其贴壁生长。
含量以每克金柑（干重）所含有的没食子酸当量（mg 用完全培养基溶解一定质量的 LPS，使其终质量浓
GAE/g DW）来表示。 度为 1 mg/L，再用含有 LPS 的完全培养基溶解不同
1.2.4 响应面优化金柑结合多酚提取工艺 质量的 NEPP，配成实验所需的质量浓度，每个质
在单因素实验基础上，根据 Box-Behnken 中心 量浓度均设置 5 个复孔。以不含样品和 LPS 的完全
组合设计原理，以金柑 NEPP 含量为响应值，分别 培养基作为空白对照组，只加 LPS 不加样品的完全
选取对结合多酚含量影响较优的因素和水平，通过 培养基作为模型组，含有 LPS 和不同质量浓度 NEPP
响应面分析法对提取条件进行优化 [19-21] ，因素水平 的完全培养基作为处理组，按每孔 200 µL 完全培养
设计见表 1。 基加入到 96 孔板中，处理 24 h 后，取各孔细胞上

表 1 结合多酚响应面因素分析水平表 清液 100 µL 于另一 96 孔板中，加入 Griess A 试剂
Table 1 Factors and levels in the response surface design 50 µL，反应 10 min，再加入 Griess B 试剂 50 µL，
水平 室温放置 10 min 后测定其在 540 nm 处的吸光度。
因素 2
–1 0 1 根据 NaNO 2 标准曲线：y=0.0011x–0.0005（R =0.9963），

A 脉冲数/次 250 350 450 其中 x 为 NaNO 2 溶液浓度（即 NO 2 浓度），μmol/L；
B 场强/(kV/cm) 8 10 12 y 为 NaNO 2 溶液吸光度。根据标准曲线计算出每孔
C 液料比/(L/g) 0.50∶1 0.38∶1 0.25∶1 
中 NO 2 质量，即为上清液中 NO 质量，将 LPS 组分
注：0 水平下的因素条件为 Design Expert 软件自动生成， 泌的 NO 质量视为 100%，其余各组与之相比，即为
非单因素实验所得。
上清液中 NO 生成量。
1.2.5 金柑 NEPP 对巨噬细胞 RAW 264.7 的免疫调 1.2.5.3 中性红法检测金柑 NEPP 对巨噬细胞吞噬
节作用 水平影响
1.2.5.1 MTT 法检测巨噬细胞的增殖作用 按照文献[26]方法并适当调整。将处于对数生
根据文献[22-24]方法并做适当改动。取对数生 长期的巨噬细胞用刮刀轻轻刮下，吹打均匀后，每