Page 102 - 《精细化工》2021年第6期
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·1164·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 38 卷

            1.2 节中所述 BB 种子液依次加入到装有 170 mL 赫                    RSPIN kit for Soil（美国 Mpbio 公司）试剂盒提取样
            奇逊氏无机盐培养液的 250 mL 锥形瓶中，用封口膜                        品的基因组 DNA，选取Ⅴ3~Ⅴ4 可变区，使用 338F
            封口后，将其置于 38  ℃，180 r/min 恒温培养振荡器                   （ 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ ）和 806R
            中培养，BB 接种量 0.23%（相对 BCF 绝干质量）。                     （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物进行
            和 HBB 组相比，另外两处理组的区别在于：一组所                          PCR，扩增产物经质量分数为 2%琼脂糖凝胶电泳
            用 BCF 事先于 121  ℃下保持 15 min，以消除体系中                  检测后，使用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美
            HM 的作用，简称 BB 组；另一组保留 BCF 中自携                       国 Axygen Biosciences 公司）建库试剂盒进行文库
            带的微生物菌系，而不接种 BB，该组简称 HM 组，两                        构建，构建好的文库经 QuantiFluor™-ST（美国
            组的其他操作同 HBB 组。所有处理组的 BCF 初始质                       Promega 公司）定量，文库合格后使用 MiSeq PE300
            量浓度均为 10 g/L，pH 6.8，每组处理重复 3 次。                    平台（美国 Illumina 公司）进行上机测序。
                 分别收集处理 0、7、11、15 d 后样品，测定 pH                  1.6   生物信息处理和理化数据统计
            后，采用高速冷冻离心机于 4  ℃，5000 r/min 离心                        对原始数据进行过滤、拼接后，得到有效序列，
            5 min。离心后的残渣采用冷冻干燥机干燥后进行理                          以 97%相似度将序列聚类成 OTUs，采用 Silva 数据
            化分析和结构表征，对应的样品分别标记为 HBB0、                          库和 RDP classifier 算法对 OTUs 的代表序列进行分
            HBB7、HBB11 和 HBB15，收集的上清液即为粗酶                      类学注释。根据分类学分析结果，进行 OTUs 丰度、
            液，用来进行酶活性分析。另准备离心后新鲜残渣                             多样性指数等分析，同时对物种注释在门和属水平
            于–80  ℃立即冷冻，送往上海美吉生物信息科技有                          进行群落结构的统计分析。在以上分析的基础上，
            限公司进行细菌多样性测定。                                      采用 bray_curtis 距离算法的主坐标（PCoA）分析和
            1.4   理化分析、酶活性及结构表征                                相似度（Anosim）分析对比不同样本组间群落结构
            1.4.1   理化指标                                       相似性或差异性。采用 Student T 检验和双尾检验分
                 pH 采用酸度计测定；BCF 干物质损失率采用                       析评估不同样本组间物种差异显著水平及差异物
            处理前后的样品在 105  ℃烘 4 h 的质量差测定，同                      种。采用单因素方差分析及 Student T 检验分析检验
            时定量样本中的蛋白质含量，以校核降解过程中的                             各样本间理化指标的统计学差异。采用 Origin pro
            干物质损失；蛋白质的含量（质量分数）是在采用                             8.0 软件进行图形的绘制。所有测量值均为 3 次结果
            凯氏定氮仪测定有机氮的基础上通过 6.25 系数校                          的平均值（平均值±标准差）。所有分析均以 P<0.05
            正获得    [14] 。                                      作为差异具有统计学意义的判断标准。
            1.4.2   酶活性
                 纤维素 CMCase 酶和半纤维素木聚糖酶活性分                      2   结果与讨论
            别以 CMC-Na、山毛榉木聚糖为反应底物，以柠檬                          2.1   降解过程中不同微生物区系下理化特征和酶
            酸钠溶液提供缓冲环境，采用 DNS 法测定                 [15] ；木质         活性的变化
            素漆酶活性测定        [16] ：取 2 mL 用 0.1 mol/L，pH 为
                                                                   图 1 为 BB、HM 和 HBB 下降解过程 pH、蛋白
            4.5 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制成 0.5 mmol/L 的
                                                               质质量分数的变化。蛋白质包括微生物及其次生代
            ABTS 溶液，室温下加入 1 mL 经适当稀释的粗酶液
                                                               谢产物，其含量是用来粗略表达微生物含量的指标。
            启动反应，测反应最初 5 min 内 λ=420 nm 处吸光度
                                                               从图 1 可以看出，随着发酵时间的推进，3 种体系
            的变化。一个漆酶酶活单位（U）定义为每分钟氧
                                                               下的 pH 和微生物含量均呈上升趋势。
            化 1 µmol ABTS 所需酶量。

            1.4.3   结构表征
                 聚合度（DP）采用铜乙二胺黏度法测定                 [17] ；结
            晶结构采用 X 射线衍射仪分析，测试条件：靶材 Cu，
            管电压 30 kV，管电流 10 mA，扫描范围为 5°~60°；
            X 射线结晶指数（CrI）采用 Segal 等所述方法进行
            计算  [18] ；化学键和官能团是样品经 KBr 压片后，采
            用红外光谱仪获得。
            1.5   样本 16S rRNA 基因测序
                 将样品在冰上融化后，充分混合以保证菌体在

            样品中的均匀分布，取样并离心。使用 FastDNA®
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