Page 137 - 《精细化工》2021年第7期
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第 7 期                    周   萍，等:  黑豆皮花色苷的酶法酰化制备及其稳定性分析                                 ·1419·


            7 个不同 pH（1、3、5、7、9、11、13）储存条件，                     化率为 75.69%，反应体系 C 中 C3G 的酰化率比体
            所有实验设 3 个平行。具体操作如下：以甲醇为溶                           系 A 明显增加；添加助溶剂 DMSO 的反应体系 B，
            剂制备质量浓度为 20 g/L 的 C3G-La 和 C3G 母液；                 C3G 酰化率仅为 14.66%，甚至低于未使用助溶剂的
            用甲醇、盐酸、氢氧化钠配制 7 个 pH 的系列梯度                         体系 A，这可能是由于 DMSO 易使酶失活，从而抑
            溶液；在各样品储存瓶中加入 4.95 mL 对应 pH 系列                     制了反应的进行       [25] 。DMF 作为助溶剂可促进反应底
            梯度溶液，其中光照组 C3G-La 与避光组 C3G-La                      物在反应介质中的溶解程度，利于反应进行，酰化
            每瓶加入 50 μL 质量浓度为 20 g/L 的 C3G-La，光照                率较单独使用叔丁醇显著提高，且底物无需长时间
                                                               预溶处理，工业化前景更佳，因此，选定 V(DMF)∶
            组 C3G 与避光组 C3G 每瓶加入 50  μL 质量浓度为
                                                               V(叔丁醇)=1∶9 作为花色苷酰化反应体系的溶剂。
            20 g/L 的 C3G，将样品摇匀，分别静置在光照与避
                                                               2.2   底物原料对 C3G-La 酰化反应的影响
            光的环境中储存。在第 1、5、10、15、20 d 将样品
                                                                   底物原料对 C3G 的酰化率有显著影响，相同反
            取出，拍照记录，并从每个样品中取出 200 μL，经
                                                               应条件下，底物纯度越高，花色苷酰化率越高。以
            0.45  μm 有机系微孔滤膜（尼龙）过滤，用 HPLC
                                                               叔丁醇作为反应介质，采用花色苷质量分数为
            检测 C3G-La 和 C3G 的保留率，方法同 1.2.4 节，
                                                               35.8%的黑豆皮提取物为反应底物，花色苷的酰化率
            样品 C3G-La、C3G 保留率按式（1）计算：
                                                               仅有 3.47%。DMF 的添加使花色苷在叔丁醇体系中
                                实际样品总含量
                    保留率    / %                 100  （1）      的酰化率由 3.47%显著提高至 66.59%，提升接近 20
                                空白样品总含量
            式中：HPLC 测得样品含量，mg；空白样品总含量，mg                       倍，其中，C3G 标准品在反应体系 D 中的酰化率达
                                                               到了 84.88% ，高于 GUIMARÃES 等           [23] 研究的
            1.2.8   数据分析
                                                               C3G-La 的酰化率。本研究尝试采用 DMF 作为助溶
                 数据采用 Microsoft Excel 处理，以“平均值±
                                                               剂辅助底物黑豆皮提取物中花色苷的释放和溶解，
            标准差”形式表示。采用 SPSS Statistics 19 对花色
                                                               促进反应进行。反应体系 F 采用黑豆皮提取物为反
            苷及酰化花色苷在不同 pH、光照和避光条件下的稳
                                                               应底物，V(DMF)∶V(叔丁醇)=1∶9 为反应溶剂，
            定性进行方差分析。Duncan 检验用于对样本进行多重
                                                               C3G 的酰化率（66.59%）虽低于以 C3G 标准品（纯
            比较，P<0.05 表示存在显著差异。采用 Python 3.8.0
                                                               度>98%）为底物的酰化率，但在工艺上底物无需经
            对花色苷及酰化花色苷稳定性实验数据进行热力图分
                                                               Sephadex LH-20 分离纯化，具有产业化可行性，对
            析。
                                                               设备要求低，可大大降低生产成本。本研究实现了
            2   结果与讨论                                          以黑豆皮提取物（C3G 质量分数为 35.8%）直接作
                                                               为酰化反应原料，在降低成本、简化工艺的同时，
            2.1   助溶剂对 C3G-La 酰化反应的影响                          保障了酰化率，使其工业化生产成为可能。
                 在以往的研究中，多采用叔丁醇、叔戊醇作为                          2.3   C3G-La 的分离和纯化及产品纯度测定
            反应介质     [20,23] ，但由于花色苷底物在叔丁醇、叔戊                      反应溶液经乙酸乙酯与水液液萃取后，减压蒸馏
            醇中溶解度低，反应前需要进行长时间的加热预溶                             得到酰化花色苷粉末，经 HPLC 检测粉末中目标产物
            处理，工艺繁琐。而在配制 C3G 酰化反应体系时，助                         C3G-La 纯度为 82.39%，产品纯度可满足大部分工业
            溶剂的加入可增大 C3G 在叔丁醇中的溶解度，更有                          生产需求。因此，本研究建立的酰化花色苷制备工艺
            利于酰化反应的进行，简化工艺流程。CRUZ 等                     [24]   无需对底物及产物进行柱层析或高效液相色谱纯化，
            采用乙腈与 DMSO 作为反应介质对黑加仑果皮中提                          生产成本及能耗大大减低，产品产率高，纯度可达
            取的花色苷进行酰化，最终选取 V(DMSO)∶V(乙                         80%以上，为实现工业化生产提供了方案及借鉴。
            腈)=1∶10 的体系为最佳溶剂，但未测定酰化率。DMF                           采用正相硅胶对乙酸乙酯萃取的酰化产物进行
            和 DMSO 常用作有机反应的助溶剂，可提高花色苷                          二次分离纯化。经检测，纯化后产品 C3G-La 的纯
            在反应溶剂中的溶解度           [24] 。因此，本文在前期研究              度达 97.58%，满足科研与制药业的需求。以往研究
            选取的叔丁醇反应介质体系             [18,20] 中分别添加助溶剂          为获得高纯度酰化花色苷产物标准品均采用高效制
            DMSO 和 DMF，分析助溶剂的使用对 C3G 酰化率                       备液相色谱对产物进行分离纯化，上样体积不大于
            的影响。反应体系的溶剂可直接影响 C3G 的酰化率，                         1 mL [18,20] ，不适于工业化生产。而本研究开发了正
            体系 A、E 直接采用叔丁醇作为反应介质，原料在                           相硅胶纯化工艺，易于实现大量制备高纯度（>97%）
            叔丁醇中需 60 ℃预溶过夜，再进行酰化反应，其余                          目标产物，有望实现产业化生产。
            4 个反应体系采用助溶剂 DMSO 或 DMF 促进溶解，                          通过以上研究，针对不同产品需求，本文提供
            其中，体系 B 采用 DMSO 作为助溶剂，C3G 酰化率                      了月桂酸酰化花色苷制备工艺：以黑豆皮提取物为
            为 14.66%；体系 C 采用 DMF 作为助溶剂，C3G 酰                   原料，采用 DMF 与叔丁醇为反应介质得到酰化产
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