Page 136 - 《精细化工》2021年第7期

·1418· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷

表 1 C3G-La 的反应体系配制及条件
Table 1 Reaction medium and conditions for preparation of C3G-La
反应 花色苷 溶剂 反应条件
体系 比例 溶剂组成
A LH-20 纯化 C3G 花色苷∶溶剂=10∶1（g∶L） 叔丁醇 预溶过夜，60 ℃、反应 72 h
B LH-20 纯化 C3G 花色苷∶溶剂=10∶1（g∶L） V(DMSO)∶V(叔丁醇)=1∶9 60 ℃、反应 72 h
C LH-20 纯化 C3G 花色苷∶溶剂=10∶1（g∶L） V(DMF)∶V(叔丁醇)=1∶9 60 ℃、反应 72 h
D C3G 标准品 花色苷∶溶剂=10∶1（g∶L） V(DMF)∶V(叔丁醇)=1∶9 60 ℃、反应 72 h
E 黑豆皮提取物 花色苷∶溶剂=10∶1（g∶L） 叔丁醇 预溶过夜，60 ℃、反应 72 h
F 黑豆皮提取物 黑豆皮∶溶剂=3∶50（g∶mL） V(DMF)∶V(叔丁醇)=1∶9 60 ℃、反应 72 h

1.2.4 HPLC 二级阵列检测器（HPLC-DAD）与 （2）萃取分离
HPLC-MS/MS 分析 用 20 mL 饱和 NaCl 溶液、20 mL 饱和 NaHCO 3
HPLC-DAD 分析：从表 1 的反应体系 B、C、D、 溶液、50 mL 乙酸乙酯交替润洗圆底烧瓶中反应浓
F（含助溶剂 DMSO 或 DMF）各取 100 μL，减压蒸 缩液，转移至分液漏斗，充分振荡，使其混合均匀，
馏干燥除去叔丁醇，每组各加入 990 μL 甲醇溶液进 静置 5~8 min 至明显分层，上部分为含有目标产物
行溶解；A、E（不含助溶剂）各取 100 μL，减压蒸 C3G-La 的乙酸乙酯相，下部分为含有 C3G 的水相；
馏干燥除去叔丁醇，每组各加入 1000 μL 甲醇溶液 收集乙酸乙酯相，水相用 80 mL 乙酸乙酯继续萃取，
进行溶解，经 0.22 μm 有机系微孔滤膜（聚醚砜） 重复萃取 8~10 次直至乙酸乙酯相颜色接近透明，水
除去 Novozyme 435 后，采用高效液相色谱（HPLC） 相经 TLC 监测已无目标产物 C3G-La 为止；将乙酸
进行定量分析，色谱柱为 Phenomenex Aeris peptide 乙酯相收集合并，减压蒸馏去除有机溶剂，收集粉
XBC18（3.6 μm×150 mm×4.60 mm），检测器为 末，于–20 ℃避光保存。
SPD-M20A 光电二极管阵列检测器；洗脱条件：流 （3）正相硅胶纯化
动相为 A 泵溶液 V(甲酸)∶V(水)=5∶95，B 泵溶液 将萃取收集的产物用 2 mL 洗脱溶剂〔V(二氯甲
（用 B 表示，下同）V(乙腈)∶V(甲醇)=4∶6，梯度 烷)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=20∶1∶1〕溶解，上样于
洗脱程序为 0~5 min，V(B)=5%~10%；5~10 min，V(B) 150 mL（2 mm×500 mm×25 mm）硅胶层析柱，进
=10%；10~20 min，V(B)=10%~30%；20~30 min， 行柱层析分离。上样后依次加入〔V(二氯甲烷)∶
V(B)=30%~90%；30~33 min，V(B)=90%；33~35 min， V(甲醇)∶V(甲酸)=20∶1∶1（420 mL）〕、〔V(二氯
V(B)=90%~5%；35~45 min，V(B)=5%，流速：0.5 甲烷)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=15∶1∶1（340 mL）〕、
mL/min，进样量 10 μL，柱温：30 ℃，C3G 与 C3G-La 〔V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=13∶1∶1（560
检测波长均为 520 nm，采用峰面积归一法，通过 mL）〕、〔V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=10∶1∶1
C3G-La 的峰面积占比计算 C3G 的酰化率。 （200 mL）〕的洗脱液进行洗脱。如图 1 所示，将深
采用 HPLC-MS/MS 对 C3G-La 进行定性分析。 红色色带的洗脱溶剂进行收集，减压蒸馏去除有机溶
HPLC 条件与上面所述一致，MS 参数设置如下：电 剂，收集产物，于–20 ℃避光保存。
离方式为 ESI，脱溶剂（DL）管温度 250 ℃，离子 1.2.6 C3G-La 的 NMR 分析与纯度测定
源温度 300 ℃，毛细管电压 4.5 kV，以正离子模式 结构解析：经硅胶柱分离纯化后的目标产物
扫描，扫描范围为 100~1000 m/Z，产物离子扫描碰 C3G-La（10 mg）以 V(氘代三氟乙酸)∶V(氘代甲
撞能量为–25 eV。 醇)=5∶95 溶解，过 0.22 μm 有机系微孔滤膜（尼龙）
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1.2.5 酰化花色苷的分离纯化 后，用核磁共振波谱仪进行 HNMR 和 13 CNMR 分
反应液中目标产物 C3G-La 的分离纯化工艺流 析，四甲基硅烷为内标。
程如图 1 所示，具体操作如下： 纯度测定：以 C3G-La 标准品制作标准曲线，
（1）抽滤除酶 采用外标法分别测定经乙酸乙酯纯化后的 C3G-La
将反应溶液取出，容器中残留反应溶液用乙酸 与经正向硅胶纯化后的 C3G-La，将其分别溶解于甲
乙酯润洗 3 次并收集，0.45 μm 有机系滤膜（尼龙） 醇，采用 0.2 μm 有机系微孔滤膜（尼龙）过滤，用
抽滤除 Novezyme 435，收集滤液，减压蒸馏除去叔 用 HPLC-DAD 进行检测，检测方法同 1.2.4 节。
丁醇和乙酸乙酯，圆底烧瓶中剩余液体为助溶剂 1.2.7 酰化花色苷储存稳定性测试
（DMSO 或 DMF）和目标产物 C3G-La 及其他反应 稳定性实验设光照组 C3G-La、光照组 C3G，避
剩余原料。 光组 C3G-La 和避光组 C3G 共 4 组，每组分别设置