Page 143 - 《精细化工》2021年第7期
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第 7 期                     郭林新，等:  响应面优化马桑皮没食子酸的酶法提取技术                                   ·1425·


            附树脂对不同提取方法得到的没食子酸粗提取物进                             成的普鲁士蓝的浓度去分析待测物的抗氧化活性                     [21] 。
            行纯化。并用甲醇对上述纯化产物进行重结晶，从                             取 100 μL 不同质量浓度的待测样品溶液，分别添加
            而制备没食子酸产品。取没食子酸产品 10 mg，用 6 mL                     200 μL 的 PBS 缓冲溶液（pH 7.4）和质量分数 1%
            氘代二甲基亚砜（DMSO-d 6）溶解后转移至直径 5 mm                     的铁氰化钾溶液。混合均匀后于 50 ℃水浴下反应
                                               1
            核磁管中，在核磁共振波谱仪上测定 HNMR 谱、                           0.5 h。反应完成后冷却至室温，添加 200  μL  质量
            13
              CNMR 谱以及二维 HSQC 谱。通过添加内标对照                       分数为 10%的三氯乙酸，离心后取 200 μL 上清液，
            物 1,3,5-三甲氧基苯，测定没食子酸的纯度。                           并与 50 μL 质量分数为 0.1%的三氯化铁溶液混合。
            1.6   没食子酸的体外抗氧化活性                                 在 700 nm 处测定混合液的吸光度，以去离子水代替
                 称取不同方法制备的没食子酸，用去离子水配                          三氯化铁溶液的吸光度，按式（4）计算待测样品的
            制成质量浓度为 512、256、128、64、32、16、8 mg/L                还原能力：
            的没食子酸待测溶液，同时配制相同质量浓度的 V C                                        还原能力       A   A         （4）
                                                                                         7   6
            溶液作为阳性对照，测定不同质量浓度样品溶液对                             式中：A 6 为以去离子水代替三氯化铁溶液的吸光度；
            1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH•）和•OH                      A 7 为不同质量浓度样品溶液的吸光度。
                             3+
            的清除能力及对 Fe 的还原能力。                                  1.7    数据分析与处理
            1.6.1   没食子酸对 DPPH•清除率的测定                              每组实验至少进行 3 次平行实验，实验数据以
                 没食子酸对 DPPH•的清除能力按文献[19]测定                     “平均值±标准偏差”表示，并以 SPSS 24.0 统计分析
            方法。取 100 μL 不同质量浓度的待测样品溶液，添                        软件进行不同实验组结果的显著性分析，P<0.05 为
                                   –4
            加等体积的 DPPH（2×10  mol/L）溶液，充分混合                     差异具有显著性。
            后于室温下避光反应 0.5 h，反应完成后用紫外-可见
            分光光度计在 517 nm 处测定反应液的吸光度。以去                        2   结果与讨论
            离子水代替样品溶液测定吸光度，再以去离子水代
                                                               2.1   响应面优化实验结果分析
            替 DPPH 溶液测定吸光度，按式（2）计算 DPPH•
                                                               2.1.1   响应面实验结果与方差分析
            的清除率：
                                                                   采用单宁酶从马桑皮中提取没食子酸，在单因
                                       A   A                素实验基础上，以酶用量（X 1 ）、体系 pH（X 2 ）、提
                   DPPH清除率    / %   1   1  2     100    （2）
                                         A 0                 取温度（X 3 ）、提取时间（X 4 ）为自变量，没食子酸
                                                               提取率（Y）为响应值，设计四因素三水平实验。中
            式中：A 0 为以去离子水代替样品溶液的吸光度；A 1
            为不同质量浓度样品溶液的吸光度；A 2 为以去离子                          心零点实验重复 5 次，共计 29 组实验。测定每组实
            水代替 DPPH 溶液测定的吸光度。                                 验的没食子酸提取率，结果见表 2。利用软件
            1.6.2   没食子酸对•OH 清除率的测定                            Design-Expert  （8.0.6 版）中 BBD 设计模式对表 2
                 没食子酸对•OH 的清除能力按文献[20]测定方                      数据进行拟合，得到二次多项式回归方程：
            法。取 100 μL 不同质量浓度的待测样品溶液，分别                          Y  10.01 1.75X  1   0.24X   2  0.87X   3
                                  –3
            加入 100 μL 浓度为 9×10  mol/L 的水杨酸钠溶液和                     0.40X  0.80X X   1  2  0.17X X   1  3  0.16X X   1  4
                                                                        4
            硫酸亚铁溶液，再加入 100  μL 双氧水（质量分数                            0.70XX   0.055XX   2  4  0.18X X   3  4  0.96X   1 2
                                                                        2
                                                                           3
            0.01%），混合均匀后于 37 ℃水浴下反应 0.5 h，反                        0.66X   2  0.99X   2  0.13X  2
            应完成后用紫外-可见分光光度计于 510 nm 处测定                                 2       3       4
                                                                   对该回归模型进行差异显著性检验及方差分析
            吸光度。以去离子水代替双氧水测定吸光度，并以
                                                               （ANOVA），结果如表 3 所示。
            去离子水代替样品溶液测定吸光度，按式（3）计算
                                                                   由表 3 可知，实验所建立的模型的 F 值为 17.97，
            •OH 清除率：
                                                               P<0.0001，达到了极显著水平。模型的失拟项的 F
                                      A  A 
                    •OH清除率    / %   1   4  5     100    （3）   值为 3.79，P 值为 0.1056（P>0.05），说明该模型的
                                        A 3                  失拟项差异不显著，影响响应值的各因素均已包含
            式中：A 3 为以去离子水代替样品溶液测定的吸光度；                         在模型范围内，回归模型中无失拟因素存在。模型
                                                                               2
            A 4 为不同质量浓度样品溶液的吸光度；A 5 为以去离                       的校正相关系数 R Adj =0.8946，表明响应值没食子酸
            子水代替双氧水测定的吸光度。                                     提取率有 89.46%受模型中所涉及的各因素的影响。
                                                                               2
            1.6.3   没食子酸对铁离子还原能力的测定                            模型的相关系数 R =0.9473，说明响应值马桑皮没食
                                    3+
                 由于铁氰化钾中的 Fe 可在抗氧化剂的作用下                        子酸提取率与模型预测的实验结果相匹配。通过模
            被还原，从而形成亚铁氰化钾，进一步可以和三氯                             型的显著性检验和误差分析，发现此模型可以对马
            化铁反应生成普鲁士蓝。因此，可通过测定反应生                             桑皮没食子酸的提取率结果进行检测。此外，不
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