Page 112 - 《精细化工》2023年第11期

·2424· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

孔中加入 MTT 溶液（20 μL，质量浓度为 5 g/L）孵 图 1a 可知，MQH 2 O 2 中硼酸酯部分与 H 2 O 2 反应后
育 4 h。完成后除去上清液，接着加入 150 µL DMS， 硼酸酯脱落，释放荧光团 MHQMB（离子状态）。为
低速振荡 10 min，用酶标仪测试各体系在 490 nm 处 了解 MQH 2 O 2 对 H 2 O 2 响应 的机 理， 在
的吸光度。通过式（3）计算细胞存活率： B3LYP/6-31G(d)水平，利用 DFT 完成了 MHQMB（包
A 括中性状态和离子状态，在水环境中）和 MQH 2 O 2
CR / %   100 （3） 的计算（图 1b）。结果显示，MQH 2 O 2 与 MHQMB
A 0
（中性状态）分子能隙〔最高占据分子轨道（HOMO）
式中：CR 为细胞存活率，%；A 和 A 0 分别为 MQH 2 O 2
实验组（细胞孵育探针组）和对照组（细胞未孵育 向最低未占有分子轨道（LUMO）激发所需要的能
探针组）的吸光度。 量〕可忽略不计，且均比 MHQMB（离子状态）分
1.4.3 细胞外源性 H 2 O 2 的检测 子能隙高，表明该分子发生分子内电荷转移（ICT），
使用不同浓度（0、10、50、100 µmol/L）的 最终导致分子能极差发生变化，光物理性质随之改
H 2 O 2 分别孵育细胞 30 min 后，PBS（pH=7.4）洗涤 变。此外，苯并噻唑上的甲氧基增加了 MQH 2 O 2 电
除去残留的 H 2O 2，利用 10 µmol/L 探针 MQH 2O 2 孵育 子云密度，提高了探针 HOMO 和 LUMO 的对称性，
10 min。成像时双光子激发波长设置为 730 nm，荧光 从而保证其较高的荧光量子产率。

收集范围为 420~480 nm（蓝色通道）及 530~600 nm
（绿色通道）。
1.4.4 OGD/R 细胞模型的建立
在无糖及无血清的 DMEM 细胞培养基中，将
PC12 细胞置于三气培养箱中（37 ℃，赋予细胞无
氧环境）孵育不同时间（0、3、6、12 h）后，使用
含有葡萄糖和血清的 DMEM 细胞培养液替换原培
养液，并在 37 ℃培养箱中常氧培养 PC12 细胞 12 h
建立细胞 OGD/R 模型。Sham 组（假手术组）指细
胞未进行 OGD/R 处理，只用 MQH 2 O 2 （10 µmol/L）
孵育 20 min；对照组为细胞进行 OGD/R 12 h 处理
后孵育 MQH 2 O 2 （10 µmol/L）20 min。NOX-2KD
组为利用病毒法将胞内 NOX-2（ROS 合成蛋白）基
因敲击（NOX-2KD）后进行 OGD/R 处理并孵育
MQH 2 O 2 （10 µmol/L）20 min；阴性对照组（Negative）
与 NOX-2KD 组对应，为阴性对照组，通过孵育未
有 DNA 结构的病毒，由于无法干扰细胞正常 DNA
序列导致无法实现 NOX-2 蛋白的敲除。细胞成像前
将 PC12 细胞用 PBS（pH=7.4）清洗 2 次，成像时
双光子激发波长设置为 730 nm，荧光收集范围为
420~480 nm（蓝色通道）及 530~600 nm（绿色通道）。
1.4.5 MCAO 模型的建立

取 8~10 周龄的 C57BL/6 雄性小鼠饲养在(22±
图 1 探针 MQH 2 O 2 与 H 2 O 2 的响应机理（a）；优化
2) ℃、相对湿度 50%±10%条件下，统一喂食标准饮
食（AIN-93M），12 h 光/暗周期进行 2 周的适应性 MHQMB（离子状态）、MHQMB（中性状态）及
MQH 2 O 2 的 DFT 分子轨道图（b）
喂养。所有的实验步骤遵循实验动物护理和使用指
Fig. 1 Response mechanism of probe MQH 2 O 2 and H 2 O 2
南：第八版，ISBN-10：0-309-15396-4，由武汉大学 (a); DFT molecular orbital diagrams of optimized
MHQMB (anion form), MHQMB (neutral form)
动物伦理委员会批准（No. WDRM-20170504）。
and MQH 2 O 2 (b)
MCAO 模型的建立根据文献[15]操作。
2.2 探针荧光响应
2 结果与讨论 2.2.1 双光子荧光活性截面
按照 1.3 节实验方法，通过双光子诱导荧光法
2.1 探针 MQH 2 O 2 的合成方法、响应机理及密度泛 测定并计算 MQH 2 O 2 （ 10 µmol/L ）与 H 2 O 2
函理论（DFT）分子轨道图 （200 µmol/L）在反应前后的双光子荧光活性截面，
MQH 2 O 2 与 H 2 O 2 的识别机理如图 1a 所示。由 结果如图 2 所示。