Page 174 - 《精细化工》2023年第3期

·630· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

1.2.7 ABTS 自由基清除能力的测定 盐缓冲液代替样液。空白组用 0.0067 mol/L pH7.2
实验方法参照文献 [14] 。称取 0.0384 g ABTS 试 PBS 磷酸盐缓冲液代替样液和酪氨酸酶溶液。每孔
剂并用蒸馏水定容至 10 mL；称取 0.0134 g 过硫酸 总反应体积 205 μL，所有溶液均用 0.0067 mol/L pH7.2
钾用蒸馏水定容至 10 mL。将上述两种试剂以体积 磷酸盐缓冲液配制，按式（8）计算酪氨酸酶抑制率：
比 1∶1 的比例混合，避光 12 h 得到 ABTS 工作液。  A  A 
酪氨酸酶抑制率 /%= 1  12 22   100 （8）
临用前以 0.1 mol/L pH=7.4 PBS 缓冲溶液（77.4 mL A  A
 32 42 
0.1mol/L 的 Na 2 HPO 4 溶液与 22.6 mL 0.1 mol/L 的 式中：A 12 为实验组的吸光度；A 22 对照组 a 的吸光
NaH 2 PO 4 溶液混合）将其稀释至在 734 nm 下的吸光
度；A 32 为对照组 b 的吸光度；A 42 为空白组的吸光度。
度为 0.70±0.02。样品及阳性对照品水溶性 V E 用体 1.2.10 弹性蛋白酶抑制实验
积分数为 95%乙醇水溶液配制成 0~1 g/L 梯度质量
将样品及阳性对照品 EGCG 配制成 0~40 g/L 梯
浓度样液。96 孔板中加入 25 μL 不同浓度样液、125
度质量浓度样液。称取 0.2 mg 弹性蛋白酶粉末溶于
μL ABTS 溶液，避光反应 6 min，用酶标仪在 734 nm 20 mL 0.01 mol/L pH=8.0 的 Tris-HCl 缓冲溶液，配
处读取实验组吸光度。对照组用 0.1 mol/L pH=7.4 制成 0.5 U/mL 的弹性蛋白酶溶液。96 孔板中加入
PBS 缓冲 溶 液代替 ABTS 工作液 。空白 组用 20 μL 样品溶液、130 μL 1.015 mmol/L N-(甲氧基琥
0.1 mol/L pH=7.4 PBS 缓冲溶液代替样液。按式（6） 珀酰基)-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-缬氨酸-4-
计算 ABTS 自由基清除率： 硝基苯胺溶液，25 ℃温育 5 min 后加入 15 μL
 A  A  0.5 U/mL 弹性蛋白酶溶液，25 ℃放置 30 min，酶
ABTS自由基清除率 /%= 1  1 2   100 （6）
 A 3  标仪读取 410 nm 处实验组吸光度。对照组 a 用
式中：A 1 为实验组的吸光度；A 2 为对照组的吸光度； 0.01 mol/L pH=8.0 的 Tris-HCl 缓冲溶液代替弹性蛋
A 3 为空白组的吸光度。 白酶溶液。对照组 b 用 0.01 mol/L pH=8.0 的 Tris-HCl
1.2.8 DPPH 自由基清除能力的测定 缓冲溶液代替样液。空白组用 0.01 mol/L pH=8.0 的
实验方法参照文献 [14] 。称取 6 mg DPPH 干粉用 Tris-HCl 缓冲溶液代替样液和弹性蛋白酶溶液。每
体积分数 95%的乙醇水溶液定容至 100 mL，即配制 孔总反应体积 165 μL，所有溶剂均用 0.01 mol/L
成 1×10 –4 mol/L 的 DPPH 工作液。样品及阳性对照 pH=8.0 的 Tris-HCl 缓冲溶液配制，按式（9）计算
水溶性 V E 用体积分数为 95%乙醇水溶液配制成 弹性蛋白酶抑制率 [26] ：
0~1 g/L 梯度质量浓度样液。96 孔板中加入 50 μL  A  A 
弹性蛋白酶抑制率 /%= 1  13 23   100 （9）
不同浓度样液、100 μL DPPH 工作液，避光反应  A  A 43 
33
30 min，用酶标仪在 517 nm 处读取实验组吸光度。 式中：A 13 为实验组的吸光度；A 23 为对照组 a 的吸光
对照组用体积分数 95%的乙醇水溶液代替 DPPH 工 度；A 33 为对照组 b 的吸光度；A 43 为空白组的吸光度。
作液。空白组用体积分数 95%的乙醇水溶液代替样 1.2.11 联合指数（CI）
液。按式（7）计算 DPPH 自由基清除率： 利用联合指数法 [27] 判断金银花多酚、红豆越橘
 A  A  乙醇提取物及 m(金银花多酚)∶m(红豆越橘乙醇提
DPPH自由基清除率 /%= 1  11 21   100 （7）
 A 31  取物)=4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4 复配物在清
式中：A 11 为实验组的吸光度；A 21 为对照组的吸光 除 ABTS 自由基、清除 DPPH 自由基、抑制酪氨酸
度；A 31 为空白组的吸光度。 酶活性和抑制弹性蛋白酶活性方面是否具有协同增
1.2.9 酪氨酸酶抑制实验 效作用，按式（10）计算 CI：
将样品及阳性对照品曲酸配制成 0~20 g/L 梯度 CI= D 1  D 2 （10）
质 量浓度 样液。称取 0.8 mg 酪氨酸酶粉末 D x1 D x2
（1240 U/mg）加入 13.23 mL 0.0067 mol/L pH 7.2 式中：D 1 和 D 2 分别为联合作用抑制率为 50%时金
PBS 磷酸盐缓冲液，配制成 75 U/mL 的酪氨酸酶溶 银花多酚和红豆越橘乙醇提取物的作用质量浓度，
液。96 孔板中加入 40 μL 样品溶液、40 μL 75 U/mL g/L；D x1 和 D x2 分别为单独作用抑制率为 50%时金
的酪氨酸酶溶液、85 μL 0.0067 mol/L pH 7.2 PBS 磷 银花多酚和红豆越橘乙醇提取物的作用质量浓度，
酸盐缓冲液，37 ℃温育 15 min，加入 40 μL 10 g/L。CI>1 为具有拮抗效果；CI=1 为具有相加效果；
mmol/L 的左旋多巴溶液，37 ℃温育 10 min，用酶 0.7< CI <1 为具有轻微协同效果；0.3< CI <0.7 为具
标仪在 492 nm 处读取实验组吸光度。对照组 a 用 有协同效果；CI< 0.3 为具有强协同效果。
0.0067 mol/L pH 7.2 PBS 磷酸盐缓冲液代替酪氨酸 1.3 统计分析
酶溶液。对照组 b 用 0.0067 mol/L pH7.2 PBS 磷酸 每组实验平行测定 3 次，表示为平均值±标准