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·68· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

CPS-2、CPS-3。 所用样品体积，mL；ρ为样品质量浓度，g/L。
1.2.3.2 Sephadex G-75 纯化多糖 1.3.5 傅里叶红外光谱分析
将经过 DEAE-52 纯化得到的 3 个组分用蒸馏水 取 1 mg 多糖样品与 150 mg 的 KBr 混合，充分
配成 50 g/L 的多糖溶液，再缓慢倾倒入平衡过的 研磨混匀后压片，以空气为空白对照，利用红外光
Sephadex G-75 色谱柱（平衡方法同 1.2.3.1 小节） 谱仪进行扫描，扫描波长为 400~4000 cm –1[14] 。
中。控制流速为 1 mL/min，以蒸馏水为洗脱相，每 1.3.6 核磁共振波谱分析
管收集 5 mL，每个多糖溶液收集 40 管。用苯酚-硫 称取多糖样品 30 mg，溶于 500 L 的 D 2 O 中，
13
1
酸法测定多糖含量并绘制洗脱曲线。将曲线峰尖处 利用核磁共振波谱仪进行 HNMR和 CNMR分析 [15] 。
试管中的多糖溶液收集，合并，冻干，得到海参斑 1.3.7 GPC 测海参斑软骨多糖的相对分子质量 [16]
软骨多糖 3 个组分的纯品，分别是 FCPS-1、FCPS-2、 色谱条件：AGuard+1xA6000M 凝胶柱；流动相
FCPS-3。 为 0.1 mol/L NaNO 3 +质量分数为 0.02% NaN 3 ，流速
1.3 表征与测试 0.7 mL/min；柱温 35 ℃；进样 100 L，标样为已
1.3.1 多糖的紫外波长扫描 知相对分子质量的聚乙二醇(相对分子质量分别为
用蒸馏水将纯化后多糖配成 1 g/L 的多糖溶液， 6100、10250、65000、98400 Da），检测器为 Viscotek
以蒸馏水为参比，将多糖溶液置于紫外分光光度计 TDA305max 多检测器。
下，在 190~400 nm 进行紫外波长扫描。 测定方法：将已知相对分子质量的标准品分别
1.3.2 多糖样品的化学组成分析 用流动相配制成 1.0 g/L 的溶液，进样量为 100 µL，
[9]
3 种多糖的总糖含量采用苯酚-硫酸法 测定， 记录色谱图，用 Breeze GPC 软件以标准聚乙二醇相
糖醛酸含量采用硫酸咔唑法测定 [10] ，蛋白含量采用 对分子质量的对数 lgM W 对洗脱体积进行回归处理，
考马斯亮蓝染色法测定 [11] 。 得到 lgM W -洗脱体积的标准曲线。将多糖样品用流
1.3.3 多糖的扫描电镜观察 动相配制成 1.0 g/L 的溶液，进样 100 µL，测得多糖
将双面胶粘到铝台上，并取少量干燥海参斑软 样品的保留时间，利用标准曲线求得多糖相对分子
骨多糖在铝台上涂抹均匀，用洗耳球轻轻将铝台吹 质量。
干净，然后放入仪器中镀金，最后将处理好的样品 1.4 海参斑软骨多糖的体外抗氧化活性分析
放入扫描电子显微镜中观察多糖的表面微观形态 [12] 。 1.4.1 海参斑软骨多糖的 DPPH 自由基清除率的
1.3.4 海参斑软骨多糖的肝素效价测定 [13] 测定 [17]
表 1 为肝素效价标准曲线配制表。 取肝素效价活性最高部分配制成 0.1、0.5、1.0、
2.0、3.0、4.0、5.0 g/L 多糖溶液 2.0 mL，加入 2.0 mL
表 1 肝素效价标准曲线配制表(单位 mL) 0.2 mmol/L 的 DPPH-甲醇溶液。室温下避光反应
Table 1 Standard curve configuration of heparin sodium titer 60 min，蒸馏水作为参比，517 nm 处测多糖溶液的吸
0 # 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 # 7 # 光值 A 1 ；蒸馏水水代替多糖，相同条件下测吸光度
肝素标准 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1.0 2.0 值 A 0 。DPPH 自由基清除率（I）的计算如式（2）
蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.0 0 所示。
Heparin 检测液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 A  A
I /%  0 1  100 （2）
天青显色液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 A 0

1.4.2 ABTS 自由基清除能力的测定 [18]
#
干净离心管，按照表 1 进行操作，以 0 号管为 分别配制 7 mmol/L 的 ABTS 溶液和 2.45
空白对照，加入显色液后混匀，在 505 nm 处测其吸 mmol/L 的 K 2 S 2 O 8 溶液，两者等体积混合，室温下
+
光度。以肝素标准的效价为横坐标，吸光度为纵坐 避光反应 16 h，生成 ABTS ·储备液，往储备液中
标作图，得标准曲线。按照标准曲线计算多糖的肝 加入 pH =7.0 的 PBS 缓冲液，至溶液在 734 nm 下的
素效价。准确称取一定量多糖样品，用蒸馏水配成 吸光度为 0.7±0.02 为止。配制 0.1、0.5、1.0、2.0、
+
1 g/L 的多糖溶液，然后分别取 2 mL 的多糖溶液， 3.0、4.0、5.0 g/L 的多糖溶液，加入 4 mL ABTS ·溶
加入 0.5 mL 的 Heparin 检测液和 0.5 mL 的天青显色 液，振荡摇匀，室温反应 6 min，734 nm 下测定吸
液。肝素效价的计算如式（1）所示。 光度 A ，取相同浓度的抗坏血酸作同样的显色处
1
肝素效价 = (P×V)/(ρ×V i ) （1） 理，作为阳性对照测定吸光度 A s 。以蒸馏水代替多
式中：P 为通过标准曲线计算得到的待测样品的效 糖溶液同样进行显色处理测定吸光度 A 2 。ABTS 自
价，U/mL；V 为待测样品总体积，mL；V i 为测定时 由基清除率（ I ）用式（3）计算。