Page 212 - 《精细化工》2022年第3期

·634· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷

could increase the yield of Ⅱf. Among them, R244M had the highest affinity toⅠf, the Michaelis-Menten
constant (K M) was 0.14 mmol/L, conversion number (k cat) was 0.0647 1/s, k cat/K M was 462.14 L/(s·mmol),
and the product obtained the highest yield of 36.9%±1.2%.
Key words: indole diketopiperazines; dimethylallyl tryptotphan synthase; bioactivities; site-directed
mutagenesis; fine chemical intermediates

异戊烯基化吲哚二酮哌嗪是存在于多种生物体 合成提供理论支撑。
中的一大类天然产物 [1-2] 。异戊二烯基可以通过与膜
[3]
相关蛋白质的相互作用改善生物膜的亲和力 ，进 1 实验部分
而提高异戊烯基化吲哚二酮哌嗪的生物活性，如抗
1.1 试剂与仪器
真菌、抗细菌、抗病毒、抗寄生虫、抗炎、抗肿瘤、 各种氨基酸，国药集团化学试剂有限公司；
[4]
抗雌激素活性和化学预防作用等 。目前，异戊烯
Ni-NTA 琼脂糖树脂、pGEM-T、pQE60、pIU18（用
基化吲哚二酮哌嗪的合成方法包括：对映选择性合
作 FgaPT2 过量生产的载体，并用作定点诱变的
成 法、区 域选 择性合 成法 、氨基 酸缩 合法 、
DNA 模板），德国 Qiagen 公司；高效液相色谱
Pictet-Spengler 法和固相合成法，但这些合成策略涉
（HPLC）的所有化学药品，上海星可生化有限公司；
及无水或厌氧条件，使用对环境有害的化学物质以 烟曲霉 Aspergillus fumigatus B5233（ATCC 13073）
及极端温度 [5-6] ，还需要额外的步骤来保护和脱保护 的 UniZAP XR 预制文库，美国 Stratagene 公司；大
[7]
官能团 。因此，需要一种更高效，更温和的合成 肠杆菌 BL21（DE3）pLysS 和大肠杆菌 XL1-Blue
策略。 MRF'，德国 Invitrogen 公司，分别用于克隆和表达
酶催化合成被认为是理想的途径之一，真菌细 实验；PCR 长模板链（用作 PCR 扩增反应），德国
胞内，异戊二烯基转移酶（DMATS）参与此类天然 罗氏有限公司；测试微生物，革兰氏阳性细菌：
产物的生物合成，通过 Friedel-Crafts 烷基化反应将 Bacillus subtilis 、 Staphylococcus aureus 、
[8]
异戊二烯基从不同的供体转移至各种受体 。迄今 Staphylococcus epidermis、Staphylococcus simulans；
[9]
为止，已报道的 DMATS 有 50 多个 。DMATS 基 革兰 氏阴 性细 菌： Escherichia coli 、 Klebsiella
本都使用二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）作为供体， pneumoniae 、 Proteus mirabilis 、 Pseudomonas
L-色氨酸或含色氨酸的环状二肽作为受体。例如， aeruginosa；医学真菌：Aspergillus flavus、Candida
CdpC2PT [10] 、AnaPT [11] 、FgaPT2 [12] 、5-DMATS [13] 、 albicans 、 Cryptococcus gastricus 、 Trichophyton
6-DMATSSv [14] 和 7-DMATS [15] 催化区域分别在 L-色 rubrum；农业真菌：Fusarium oxysporum、Rhizoctonia
氨酸吲哚环的 C-2、C-3、C-4、C-5、C-6 和 C-7 位。 solani、Penicillium expansum、Alternaria brassicae，
但 DMATS 在自然条件下活性较低，传统研究主要 中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）；
集中在通过优化条件来提高酶活性 [16] 。近年来，酶 HeLa 和 HepG2 细胞，第四军医大学（西安）细胞
的位点饱和诱变成为增强或改变催化活性的研究 中心；A549 和 MCF-7 细胞，中国科学院（上海）。
点，如 FtmPT1 的 Tyr205 突变体与未突变 FtmPT1 LCQ Fleet 型离子阱液质联用仪，美国 Thermo
相比，C-3 异戊烯基化衍生物的活性明显增加 [17] 。 Fisher Scientific 公司；AVANCE Ⅲ 500 MHz 核磁
FgaPT2 在 Glu89，Thr102，Lys174 和 Arg-244 这 4 共振波谱仪，德国 Bruker 公司；Agilent 1200 型高
个位点突变后的酶对 L-色氨酸和 L-酪氨酸产生了差 效液相色谱仪，美国 Hewlett-Packard 公司；BIO-RAD
异性的酶催化活性 [18-19] 。 680 型酶标仪，美国 Bio-Rad 公司。
本课题组完成了 C-7 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪 1.2 制备方法
的相关研究 [20] ，目前又聚焦 C-4 异戊烯基化吲哚二 1.2.1 酶催化合成
酮哌嗪的酶合成。本研究拟考察 FgaPT2 对不同底 1.2.1.1 DMAPP 和底物的合成
物异戊烯基化的影响，通过多种生物活性模型，拟 按照文献 [21] 合成二 甲 基烯丙 基 二磷酸
筛选出具有更高活性的 C-4 异戊烯基化吲哚二酮哌 （DMAPP），经 HPLC 测定，纯度为 96%；按照文
嗪，采用分子模型分析 FgaPT2 中与异戊烯基化活 献[22]合成反应底物（Ⅰa~Ⅰg），结构如下所示，
性相关的关键残基，基于此建立位点饱和诱变，进 纯度为 81%~92%。
而探讨突变的 FgaPT2 与底物之间相互作用的分子 1.2.1.2 FgaPT2 的表达和纯化
影响，为深入研究异戊烯基化吲哚二酮哌嗪的生物 如文献[23]所述，进行 FgaPT2 在大肠杆菌中过