Page 213 - 《精细化工》2022年第3期
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第 3 期 张弘弛，等: FgaPT2 酶催化合成 C-4 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪和定向诱变增强收率 ·635·
量生产，将 pLysS 转化至大肠杆菌 XL1-Blue MRF' C-4 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪的酶催化合成如
中，重组子形成后，接种于含液态 LB 培养基中， 下所示。以环-L-4-二甲基烯丙基-色氨酸-L-甘氨酸
补充羧苄青霉素（终质量浓度 50 mg/L），37 ℃下 （Ⅱa）的合成为例。在微量反应瓶中分别加入 1 mL
生长至在波长 600 nm 处的吸光度（OD 600 ）达 0.6。 DMAPP（1 mmol/L 去离子水溶液），8 mL 1 mmol/L
加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为 环-L-色氨酸-L-甘氨酸（Ⅰa）水溶液，100 μg 纯化
0.8 mmol/L，37 ℃将细胞再培养 16 h。离心收集菌 FgaPT2，0.5 μg MgCl 2 ，充分溶解后，加入 0.5 mL 三
体，沉淀以 2~5 g/mL 的质量浓度重悬浮于裂解缓冲 羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl（50 mmol/L）缓冲溶
液中，加溶菌酶（终质量浓度 1 g/L），冰浴孵育 液调解 pH 至 7.5，在 37 ℃下反应 12 h 后，添加 2mL
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30 min，以 200 W 的频率超声处理 6 次，每次 10 s， 甲醇终止反应。离心（1.3×10 r/min，20 min，4 ℃）
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裂解液在 4 ℃以 1.4×10 r/min 离心 30 min。用 Ni-NTA 去除蛋白质后，经真空冷冻干燥器（–20 ℃）干燥
琼脂糖树脂进行亲和层析，纯化重组融合蛋白，经聚 6 h，得到酶反应产物，收率 23.2%。其余酶催化产
丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）收集得 FgaPT2。 物的制备方法同上，只需加入对应的底物，设置反
1.2.1.3 C-4 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪的酶催化合成 应时间 6~16 h。
1.2.1.4 酶产物的 HPLC 分析、分离和结构鉴定 物Ⅰa~Ⅰg 和 C-4 异戊烯基化产物Ⅱa~Ⅱg〔设置浓
使用 Multospher 120 RP-18 色谱柱（250 mm× 度范围 12.5~100 μmol/L，溶于二甲基亚砜（DMSO）〕
4 mm×5 μm），1 mL/min 流速，通过 HPLC 分析酶 的抑制作用，HeLa，HepG2，A549 和 MCF-7 作为
产物，流动相由水和甲醇组成。线性梯度洗脱 测试细胞系。酶标仪测量 570 nm 处的吸光度，测定
20 min，甲醇体积分数从 30%升至 100%（每 4 min 达到 50%抑制效果时抑制剂的浓度（IC 50 值），根据
甲醇体积分数提高 20%），甲醇洗脱 5 min，体积分 式（1）计算抑制率：
数 30%甲醇水溶液再平衡 5 min。酶反应产物的收率 A A
抑制率 / % control test 100 （1）
通过产物的峰面积与在 277 nm 处检测到的产物和 A control
底物峰面积总和之比计算得出。酶产物分离使用 式中：A control 和 A test 分别为对照组（只含有 MTT，
COSMOSIL 5C 18 MS-Ⅱ反相柱（250 mm×10 mm× 未加测试样品的细胞培养体系）和测试组的吸光度，
5 μm），流速 2.5 mL/min，在 50~80 min 内，甲醇体 测定重复 3 次，取平均值。
积分数的线性洗脱梯度从 60%到 100%（每 10 min 1.2.2.2 抗细菌活性测试
甲醇体积分数提高 20%），甲醇洗涤 10 min 后，体 按照文献[25]所述的方法，设置Ⅰa~Ⅰg 和Ⅱa~
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积分数 60%甲醇水溶液平衡色谱柱 10 min。HNMR Ⅱg 质量浓度范围为 0.5~1024 mg/L，细菌浓度为
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鉴定其结构，电喷雾离子化质谱（ESI-MS）鉴定其 1.5×10 CFU/mL，采用微孔板测定细菌的生长状况。
相对分子质量。 含有细菌细胞和 DMSO 而不含任何测试化合物的样
1.2.2 生物活性测试 品作为对照（生长对照）和仅含有生长培养基的样
1.2.2.1 抗肿瘤活性测试 品用作对照（无菌对照），氨苄西林和环丙沙星用作
噻唑蓝溴化四唑（MTT）测定法 [24] 用于确定底 阳性对照，测试重复 3 次，通过肉眼和在 630 nm 处
