Page 214 - 《精细化工》2022年第3期

·636· 精细化工 FINE CHEMICALS
测量吸光度来观察生长，没有观察到浑浊的测试化
合物的最低浓度记录为 MIC。
1.2.2.3 抗真菌活性测试
按照文献[26-27]所述的方法，设置Ⅰa~Ⅰg 和
Ⅱa~Ⅱg 质量浓度范围为 0.5~1024 mg/L，真菌浓度
4
为(0.5~2.5)×10 CFU/mL。含有真菌细胞和 DMSO
而不含任何测试化合物的样品作为对照（生长对照）
和仅含有生长培养基的样品用作对照（无菌对照），
两性霉素 B 和多菌灵分别用作医学真菌和农业真菌
的阳性对照，测试重复 3 次，通过肉眼和在测量吸
光度观察生长，没有观察到浑浊的测试化合物的最
低浓度记录为 MIC。
1.2.2.4 抗氧化活性测试
按文献[28]测量样品对 1,1-二苯基-2-三硝基苯
肼自由基（DPPH•）的清除活性，DPPH•清除率（R）
按式（2）进行计算：
A  A
R /%  1 j i  100
A o
式中：A o 为等体积 DPPH 溶液和溶剂的吸光度；A j
为等体积测试样品和溶剂的吸光度；A i 为等体积
DPPH 溶液和测试样品的吸光度，测试重复 3 次，
取平均值。
1.2.3 饱和位点诱变提高酶催化效率
1.2.3.1 分子对接的方法
FgaPT2（蛋白质数据库 PDB 编号：3I4X）的
高级结构用作分子对接的模板，考虑底物结合袋中
的氢键网络，在模型构建过程中还包括了两种底物
分子。LeDock（http://www.Lephar.com）软件因其
高速度和准确性而用于对接研究 [29] 。在优化过程中，
产物分子和结合位点周围的侧链原子被视为柔性，
具有最低对接能量的结合姿势用作预测的结合模
式。使用 PyMOL 1.5（http://www.pymol.org）分析
和可视化对接结果。
1.2.3.2 定点诱变的操作
含有 FgaPT2 的质粒用作 PCR 诱变的 DNA 模
板，为了在所需基因位点获得特定或全部突变体（变
性），根据文献[18-19]中所述的定点诱变方案设计引
物，并由杰顿生物科技有限公司（中国上海）合成。
PCR 扩增程序中，FgaPT2 的退火温度为 62 ℃，延
伸时间为 8 min 以适应热曲线。
1.2.3.3 动力学参数测定
将 100 μg 纯化重组 FgaPT2 或突变体与 0.5 μg
CaCl 2、1 mL DMAPP（浓度 2 mmol/L）和 4 mLⅠf
（浓度梯度 0.01、0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、
1.0、2.5 和 5.0 mmol/L）混合，在 37 ℃下进行培养
60~120 min，实验重复 3 次，通过每 mg 重组蛋白每
min 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪的形成量来评估酶活
第 39 卷
性。根据 Lineweaver-Burk，Hanes-Woolf 和 Eadie-
Hofstee 图 [30] 计算出 Michaelis-Menten 常数（K M ，
mmol/L），转化数（k cat ，1/s）和 k cat /K M 。
2 结果与讨论
2.1 C-4 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪的酶催化合成
FgaPT2 酶催化合成了 7 个 C-4 异戊烯基化吲哚
二酮哌嗪，合成收率和 HPLC 分析表明，FgaPT2 对
底物具有一定的选择性。根据 ESI-MS 数据分析，
产物的相对分子质量均比各自底物的相对分子质量
大 68，而单异戊烯基相对分子质量为 68，因此表明
其结构中存在单异戊烯基团。Ⅱ系列产品（Ⅱa~Ⅱg）
的保留时间都比其底物（Ⅰa~Ⅰg）长，证明单异戊
二烯取代了非极性基团。从酶合成产物的 HNMR
1
数据可以发现，异戊烯基氢的信号，δ: 3.76~3.65 (d
或 dd, H-1′), 5.33~5.29 (t, H-2′), 1.84~1.72 (s, 3H,
H-4′)和 1.82~1.70 (s, 3H, H-5′)；而 H-1′的化学位移
（2）
证明了异戊烯基与芳族 C 原子的连接 [31-32] ；同时吲
哚环的氢信号中可以发现 3 个耦合质子，比无取代
的吲哚氢信号少了 1 个耦合质子，表明异戊烯基化
1
发生在吲哚部分。所有产物的 HNMR 与其底物的
1 HNMR 比较，明显发现，吲哚环 H-4 信号消失了，
证明异戊烯基取代位置在吲哚的 C-4 位 [31-33] ，产物
的结构表征如下：
环-L-4-二甲基烯丙基-色氨酸-L-甘氨酸（Ⅱa）：
白色固体，收率 23.2%； HNMR (500 MHz, CDCl 3 ),
1
δ: 8.21 (s, 1H, 1-NH), 7.10 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-2),
6.95 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-5), 7.16 (t, J = 7.5 Hz, 1H,
H-6), 7.27 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-7), 3.84 (dd, J =
14.7、3.0 Hz, 1H, H-10a), 3.15 (dd, J = 14.7、10.0 Hz,
1H, H-10b), 4.23 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H-11), 5.92 (s, 1H,
12-NH), 3.92 (d, J = 17.4 Hz, 1H, H-14a), 3.79 (d, J =
17.4 Hz, 1H, H-14b), 5.72 (s, 1H, 15-NH), 3.76 (d, J =
7.2 Hz, 2H, H-1′), 5.32 (t, J = 7.2、1.4 Hz, 1H, H-2′),
1.75 (s, 3H, H-4′), 1.72 (d, J = 1.0 Hz, 3H, H-5′) ; ESI-
+
MS [M+H] , m/Z: 实测值（计算值）312.4 (312.2)。
环-L-4-二甲基烯丙基-色氨酸-L-丙氨酸（Ⅱb）：
1
白色固体，收率 3.6%；HNMR (500 MHz, CDCl 3 ), δ:
8.21 (s, 1H, 1-NH), 7.10 (d, J = 2.5 Hz, 1H, H-2), 6.95
(d, J = 7.5 Hz, 1H, H-5), 7.16 (t, J = 7.5 Hz, 1H, H-6),
7.27 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-7), 3.84 (dd, J = 14.7、3.0 Hz,
1H, H-10a), 3.15 (dd, J = 14.7、10.0 Hz, 1H, H-10b),
4.24 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H-11), 5.99 (s, 1H, 12-NH),
3.96 (dd, J = 7.0 Hz, 2H, H-14), 5.75 (s, 1H, 15-NH),
0.36 (d, J = 7.0 Hz, 3H, H-17), 3.74 (d, J = 7.2 Hz, 2H,
H-1′), 5.33 (t, J = 7.2、1.4 Hz, 1H, H-2′), 1.76 (s, 3H,
+
H-4′), 1.73 (s, 3H, H-5′) ; ESI-MS [M+H] , m/Z: 实测
值（计算值）326.5（326.2）。
环-L-4-二甲基烯丙基-色氨酸-L-亮氨酸（Ⅱc）：