Page 219 - 《精细化工》2022年第3期
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第 3 期 张弘弛，等: FgaPT2 酶催化合成 C-4 异戊烯基化吲哚二酮哌嗪和定向诱变增强收率 ·641·
2.3 饱和位点诱变提高 FgaPT2 酶催化效率的研究 Arg-244 作为增加 FgaPT2 酶催化活性的突变位点。
2.3.1 对 Arg-244 进行定点诱变，增加对环-L-色氨 2.3.2 FgaPT2 中 244 位的位点饱和诱变导致对Ⅰf
酸-L-色氨酸（Ⅰf）的 C-4 异戊烯基化活性 的不同催化能力
上述研究发现，Ⅱf 在体外具有最佳的生物活 FgaPT2 以及 19 个突变体（R244A、R244N、
性，但Ⅱf 在酶催化合成反应中产量却不高，前期以 R244D、R244C、R244Q、R244E、R244G、R244H、
Ⅱf 的产量为指标，对 FgaPT2 酶催化条件进行了优 R244I、R244L、R244K、R244M、R244F、R244P、
化，但产量增量效果并不明显（在 27~37 ℃之间， R244S、R244T、R244W、R244Y 和 R244V）在预
收率差异只有 3.1%。在反应缓冲液的 pH 范围 设的研究条件下的表达水平相当，说明单一位点的
4.0~6.0、6.0~8.0、7.0~9.0 和 10.0~11.0 体系中，收 突变，对异戊烯基转移酶的表达水平几乎没有影响，
率差异只有 2.4%，不同的二价阳离子对终产物的收 这为研究 FgaPT2 及其突变体对Ⅰf 的催化能力提供
率差异只有 4.2%）。因此，本研究集中于 FgaPT2 酶 稳定的基础条件。在 1 mL DMAPP（2 mmol/L）存
位点突变以实现提高产物产量。为了解 FgaPT2 对 在的情况下，将Ⅰf 分别与 20 μg FgaPT2 以及 19 个
环-L-色氨酸-L-色氨酸（Ⅰf）的催化机制，建立了 突变体混合，在 100 μL 酶体系中于 37 ℃下进行
包括 FgaPT2、DMAPP 和Ⅰf 的分子模型（图 3）。 16 h 反应，反应混合物经 HPLC 分析表明，不同突
根据该模型分析，Tyr-189、Thr-102、Glu-89、Ser-91、 变的重组 FgaPT2 对Ⅰf 的催化活性有很大的差异
Arg-100、Try-345、Try-261（绿色）通过氢键参与结 性，结果见图 4。如图 4 所示，在 19 个 Arg-244 突
合磷酸基团，Leu-81 和 Ile-80（红色）趋于稳定侧链， 变体中，有 10 个比 FgaPT2 对Ⅰf 有更强的接受能
Met-328 和 Ieu-263（黄色）参与了与二甲基烯丙基部 力（占比 52.6%），R244M 催化的产物收率为 36.9%±
分的相互作用，这一结果与已有的研究结果一致 [34] 。 1.2%，约是 FgaPT2 的 1.8 倍。R244G 催化的产物收
已有关于 FgaPT2 酶位点突变的研究表明，Lys-174 率为 33.1%±1.6%，其次是 R244Y 为 32.5%±1.4%，
（蓝色）和 Arg-244（红色）都参与提取 C-4 质子的 约是 FgaPT2 的 1.7 倍和 1.6 倍。4 个突变体对Ⅰf
中间体的构建，该中间体用于在 C-4 攻击异戊烯基 的异戊烯基化能力与 FaPT2 相似，产物收率在
阳离子，而 ZHENG 等 [34] 选择了 3 个相关氨基酸残 20.6%~21.3%之间。5 个突变体显示对Ⅰf 催化活性
基 Thr-102、Lys-174 和 Arg-244 作为定点诱变的热 低于 FgaPT2，产品收率在 18.8%~13.4%范围内。通
点，结果表明，Arg-244 是影响 FgaPT2 酶活性的关 过 Arg-244 的定点诱变后产生系列的突变 FgaPT2
键位点，其定点诱变可以大大提高 L-色氨酸的异戊 酶，与原酶比较，52.6%的突变体显示出高于 FgaPT2
烯基化产量。因此，结合已有研究，本文也选择 的催化活性。
图 3 FgaPT2 催化模型〔使用 DMAPP 将Ⅰf 建模为 FgaPT2 的晶体结构（PDB 编号：3I4X）〕
Fig. 3 Model of FgaPT2 catalysis [Ⅰf was modelled into the crystal structure of FgaPT2 (PDB entry: 3I4X) with DMAPP]
