Page 118 - 《精细化工》2022年第4期

·754· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷

在 37 ℃、体积分数为 5% CO 2 培养箱中培养过夜， 表 1 Real-time PCR 引物序列
以 1000、500、250、100、50、25、10、1 mmol/L Table 1 Primer sequences for Real-time PCR
的双氧水分别处理细胞 1、2、3、4 h 后，以 MTT 基因 方向 引物
GADPH F GAGTCAACGGATTTGGTCGT
法检测 HSF 的活性。
R GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
1.2.5 发酵提取物缓解 HSF 衰老作用的探究
Sirt1 F TGTGGTAGAGCTTGCATTGATCTT
1.2.5.1 乳酸菌发酵提取物对 HSF 存活率的保护作用
R GGCCTGTTGCTCTCCTCATT
4
计数 HSF，以 1.0×10 个/孔的密度加入 96 孔培
FoxO3a F GCA AGC ACA GAG TTG GAT GA
养板中。在 37 ℃、体积分数为 5% CO 2 环境下培养 R CAG GTC GTC CAT GAG GTT TT
过夜。将不同乳酸菌发酵提取物处理细胞后再以双 SMP30 F CCG TGG ATG CCT TTG ACT AT
氧水（100 μmol/L）作用 HSF 2 h。检测 HSF 存活 R TCC AAA GCA GCA TGA AGT TG
率以确定发酵提取物对双氧水引起的 HSF 的氧化应 Tbx3 F CCC CTT CCT CAA TCT GAA CA
激是否存在保护作用。 R GAC ATG GAG CTG GAG GAG AG
β-catenin F CAC TAC CAC AGC TCC TTC TC
1.2.5.2 细胞样品制备
R GAG CAG CAT CAA ACT GTG TA
计数 HSF，调节细胞密度使 6 孔培养板中的细

6
胞密度为 1.5×10 个/孔。在 37 ℃、体积分数为 5% 1.2.6.2 qPCR 检测
CO 2 环境下培养过夜，弃培养基后先以发酵提取物 根据 TransStart Top Green qPCR SuperMix 试剂
作用细胞 24 h 后，再以 100 μmol/L 双氧水作用 HSF 盒说明书操作 qPCR，将反应物混合后在实时荧光定
2 h。取出，置于冰上，清洗细胞，除去双氧水，每 量 PCR 仪上进行。
孔加入 100 μL 裂解液裂解细胞，可得细胞裂解液。
4
保持 4 ℃、1.2×10 g 离心 5 min，弃沉淀得到细胞 2 结果与讨论
裂解液的上清液。 2.1 乳酸菌发酵提取物的抗氧化能力检测
1.2.5.3 HSF 内 ROS 含量的检测 在衰老的过程中，ROS 升高导致机体内抗氧化
细胞培养同 1.2.5.2 节，培养完成后以磷酸盐缓 能力的减弱。机体在外界环境刺激下，以及线粒体、
冲液（PBS，pH 7.4，0.01 mol/L）清洗细胞，加入 脂肪酸等均可产生•O 2 、H 2 O 2 、•OH 等各种过氧化因
–
质量分数为 0.25%胰酶将细胞从 6 孔板中消化，离 子，诱导细胞内物质发生过氧化并且引起细胞凋亡，
心收集细胞沉淀，参照 ROS 检测试剂盒说明书操 加速推进衰老进程 [14] 。因此，通过检测不同乳酸菌
作，以激发波长 488 nm，发射波长 525 nm 进行荧 发酵提取物对•OH 和•O 2 的清除作用来评估其防护
–
光的检测，记录荧光强度，其中荧光强度与 ROS 含 氧化损伤的能力。
量成正相关性。 2.1.1 乳酸菌发酵提取物对•OH 的清除作用
1.2.5.4 HSF 的抗氧化活性测定 不同乳酸菌发酵提取物对•OH 的清除作用结果
得到细胞裂解液及上清后按照试剂盒检测发酵 见图 1。
提取物对 HSF 中 SOD、CAT、GSH-Px、总抗氧化
能力的影响及对 MDA 含量的影响。
1.2.6 qRT-PCR 检测衰老相关基因表达量
1.2.6.1 细胞培养及总核糖核酸（RNA）的提取与
转录
6
计数 HSF，并以 1.0×10 个/孔的密度接种于 6
孔培养板中。在细胞培养箱中培养过夜，弃培养基
并用 100 μmol/L 双氧水处理细胞 2 h，吸弃双氧水，
用 PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）洗 3 次，再以质量浓

度为 5.0、2.5、0.5 g/L 的 FE1 处理细胞 24 h。Trizol 图 1 5 种乳酸菌发酵提取物对•OH 的清除作用
法提取 RNA，将抽提所得 RNA 储存于–80 ℃冰箱 Fig. 1 Scavenging effect of five different lactobacillus

中。cDNA 第 1 条链合成反应使用 EasyScript One- fermentation extracts on •OH
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 由图 1 可以看出，5 种乳酸菌发酵提取物对•OH
反转录试剂盒进行。特异性引物、引物序列见表 1。 均有一定的清除作用，但清除能力各异。FE1 质量