Page 166 - 《精细化工》2023年第12期

·2708· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/–4500 V 于 37 ℃、120 r/min 下振荡，分别在 0、3、6、9、
（负离子模式）；离子源气体Ⅰ（GSⅠ）、气体Ⅱ（GS 12 和 24 h 取样，将悬浮液以 8000 r/min 离心 10 min，
Ⅱ）和气帘气（CUR）分别为 50、60 和 25 psi；碰 保留上清液，测其电导率 [14] ，并绘制电导率变化曲
撞诱导电力参数设置为高。 线；测定上清液在 260 nm 处的吸光度（OD 260 ），用
1.3.2 MIC 测定 于检测核酸泄漏 [15] ；并使用 2,2-联喹啉-4,4-二甲酸
按照响应面优化实验得到的最佳工艺提取金 二钠（BCA）试剂盒测定蛋白质量浓度 [16] 。蛋白泄
桂、银桂、丹桂、四季桂 4 个品种的桂花总黄酮， 漏量（μg/mL）按下式计算：
收集乙醇提取液，蒸发浓缩至无醇味，加入预先浸 OD  OD
蛋白泄漏量  s 0    N （3）
泡过的大孔树脂 D101 中，加入 3 倍体积的蒸馏水， OD  OD 0 标
标
120 r/min 振荡吸附 24 h，弃上清液，再加入等体积 式中：OD s 为各处理组的吸光度；OD 0 为空白对照
的体积分数 70%的乙醇水溶液 120 r/min 振荡 24 h 组的吸光度；OD 标为蛋白标准品的吸光度；ρ标为蛋
洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，冷冻干燥得到桂花 白标准品的质量浓度，524 μg/mL；N 为稀释倍数。
总黄酮粉末，取一定量干燥后的粉末，溶于体积分 1.3.4 体外抗生物膜能力测定
数 70%的乙醇水溶液中，并按照 1.2.2 节方法计算粉 采用甲基四氮盐（XTT）比色法测定桂花黄酮
末中的黄酮含量。 对不同时间段 C. albicans 形成的生物膜的作用 [17] 。
取 0.5 mL 灭菌后的 SDB 加入 C. albicans 冻干 在避光条件下配制浓度为 1 mmol/L 的甲萘醌丙酮
粉管中，充分溶解后再加入 SDB 稀释，混匀后吸取 溶液，加入 PBS 将其稀释 10 倍，混匀，在避光条
少量菌液至灭菌后的 SDA 上，涂布均匀，置于 37 ℃ 件下加入 10 mg XTT 粉末，充分混匀，得到 XTT-甲
培养、传代 3 次后使用。挑取 C. albicans 菌落，用 萘醌溶液，0.22 μm 孔径过滤器过滤除菌，备用。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤 2 次并重悬，使用 用 RPMI-1640 培养基将 4 个品种桂花黄酮样品
6
血球计数板调整菌液浓度为 1×10 CFU/mL，备用。通 稀释至 MIC 值对应浓度，稀释 C. albicans 菌悬液浓
6
过二倍肉汤稀释法对桂花不同组分进行抑菌活性测定 度为 1×10 CFU/mL。在 96 孔板中加入 200 μL 菌液，
[13] ，首先将 4 个品种桂花黄酮样品和氟康唑用少量 37 ℃、120 r/min 下振荡培养，分别在培养 4、8、
DMSO 溶解后作为母液，然后用 RPMI-1640 培养基进 12、24 h 后吸出上层培养基及菌液，用 PBS 小心洗
行系列梯度稀释，使其工作质量浓度为 62.5~3000.0 涤 2 次附壁生物膜，去除悬浮细胞。实验分为 2 组，
μg/mL，DMSO 最终体积分数为 1.5%。样品分为 5 分别为：对照组（200 μL 培养基）和处理组（100 μL
组，分别为：空白对照组（200 μL 培养基）、生长 样品+100 μL 培养基）。再次置于 37 ℃、120 r/min
对照组（100 μL 培养基+100 μL 菌液）、阴性对照组 下振荡培养 24 h，吸出液体，用 PBS 小心洗涤 2 次，
（100 μL 样品+100 μL 培养基）、阳性对照组（100 μL 去除培养基和样品溶液，避光加入 200 μL XTT-甲萘
氟康唑+ 100 μL 菌液）和实验组（100 μL 样品+100 μL 醌溶液，37 ℃孵育 3 h 后取出，使用酶标仪于 490 nm
菌悬液）。将上述各组分别加入 96 孔板中，37 ℃下 测溶液的 OD，生物膜形成率按照下式计算：
培养 24 h，使用酶标仪测定 600 nm 处的吸光度，每 OD
生物膜形成率 /%  s  100 （4）
组实验平行进行 3 次。MIC 参考美国临床实验室标 OD CK
准化组织（CLSI）标准定义为：与生长对照孔相比， 式中：OD s 为各处理组的吸光度；OD CK 为对照组的
真菌生长被抑制 50%的最低药物浓度。 吸光度。
 OD  OD  1.3.5 统计分析
抑菌率 /%  1  1 2   100 （2）
 OD CK  OD 0  所有实验均设置 3 次重复，结果以平均值±标准
差表示。使用 Analyst 1.6.3 处理质谱数据，使用 SPSS
式中：OD 1 为各实验组的吸光度；OD 2 为各阴性对
27.0 进行统计分析和 Dunkan’s 检验，P<0.05 有统计
照组的吸光度；OD CK 为生长对照组（CK）的吸光
学意义。
度；OD 0 为空白对照组的吸光度。
1.3.3 细胞膜完整性测定 2 结果与讨论
用灭菌后的 PBS（pH 7.4）将 4 个品种桂花黄
酮样品稀释至 MIC 值对应浓度，稀释 C. albicans 菌 2.1 不同提取方式和提取条件对桂花黄酮提取率
6
悬液浓度为 1×10 CFU/mL。实验分为 2 组，在锥形 的影响
瓶中进行，分别为：对照组（6 mL PBS+ 6 mL 菌液） 按 1.2.1 节进行实验，不同提取方式得到的桂花
和处理组（6 mL 样品+6 mL 菌悬液）。将锥形瓶置 黄酮提取率如表 3 所示，超声提取桂花黄酮单因素