Page 155 - 《精细化工》2023年第5期

第 5 期 闫雅倩，等: 黄花菜发酵液的化妆品功效评价 ·1075·

在 4800 r/min 离心分离 30 min，取上清液即为酿酒酵 DMEM 培养基稀释培养的体积分数为 2.5%的黄花
母发酵制备的黄花菜发酵物（S3）250 g，得率为 83%。 菜发酵液。后续按照 TNF-α、IL-6 和 COX-2 ELISA
1.2.4 HaCaT 和 B16 细胞的培养 试剂盒说明书进行炎性因子表达量的测定。空白组
在细胞培养瓶中，将 HaCaT 和 B16 细胞置于完 不加细胞，不加样品处理；模型组为经过 UVB 照射
全培养液（含体积分数 10%胎牛血清和体积分数 1% 后的细胞模型。
青霉素-链霉素的 DMEM 培养液）中，将培养瓶置 1.2.6.2 HaCaT 细胞炎性因子 TNF-α mRNA、IL-6
于 37 ℃，体积分数 5% CO 2 潮湿的培养箱中进行培 mRNA 相对表达量的测定
养。每 2 d 更换 1 次 DMEM 培养基，当细胞密度达 样品作用于 HaCaT 细胞后，使用总 RNA 抽提
到 80%~90%进行传代。 试剂提取 RNA，具体操作参照说明书。随后，根据
®
细胞的传代（含 HaCaT 和 B16 细胞）：取出细 EasyScript One Step gDNA Removal and cDNA
胞培养瓶，倒掉瓶内培养基，使用 PBS 清洗细胞 2 Synthesis SuperMix 反转录试剂盒说明进行逆转录。
遍；每瓶加入 2 mL 胰蛋白酶；待细胞完全消化悬浮 引物及探针的设计和合成：根据美国国家生物
后，加入 4 mL 完全培养液（含体积分数 10%胎牛 技术信息中心发布的基因序列，通过 Primer Express
血清和体积分数 1%青霉素-链霉素的 DMEM 培养 软件设计出目的基因的特异性引物（包含管家基因
液）终止消化；将细胞悬浮液转移至 15 mL 离心管 β-actin），其序列见表 1。
中，于 1000 r/min 离心 5 min，弃去上清液后加入 4 mL
表 1 Real-Time PCR 引物序列
DMEM 培养基，将细胞沉淀与培养基吹打均匀，然 Table 1 Real-Time PCR primer sequences
后平均分配转移至 3 个 T75 培养瓶中，在体积分数 基因 方向 序列
5% CO 2 ，37 ℃的培养箱中进行传代培养。 β-actin F TGGCACCCAGCACAATGAA
1.2.5 细胞增殖/毒性实验 R TGGCACCCAGCACAATGAA
TNF-α F AGGACAGAAGAGCAACTGAGATCG
采用 CCK-8 试剂盒进行细胞增殖/毒性实验。 R TTGGGATGCTGACACTCCATGCA
IL-6 F GACAGCCACTCACCTCTTCA
（1）收集 HaCaT 细胞培养液，使用 DMEM 培 R TTCACCAGGCAAGTCTCCTC
4
养基，制成 1×10 个/mL 的细胞悬浮液，在 96 孔板
1.2.7 黄花菜发酵液抗氧化功效分析
中每孔加入 100 μL 细胞悬浮液。
1.2.7.1 DPPH 自由基清除实验 [10]
（2）在体积分数 5% CO 2 ，37 ℃孵育 12 h 或隔
–4
DPPH 溶液（2×10 mol/L）的配制：精确称取
夜，弃细胞培养液，实验组每孔加入 100 μL 用去离
DPPH 20 mg，用无水乙醇溶解并定容至 250 mL。按
子水稀释成不同体积分数的样品溶液（样品为无血
照表 2 顺序及添加量向试管中分别加入不同体积分
清 DMEM 培养基培养的黄花菜水提液和两种发酵
数样品水溶液，混合均匀，在酶标仪 517 nm 波长处
液）。每个体积分数设定 5 个复孔。同时，设置对照
组（含有细胞+无血清 DMEM 培养基），空白组（只 测吸光度，并按照式（2）计算 DPPH 自由基清除率。

加入 PBS）。 表 2 样品加液要求
（3）将 96 孔板在体积分数 5% CO 2 ，37 ℃的 Table 2 Sample liquid addition requirements
培养箱中孵育 24 h，然后每孔加入 10 μL 的 CCK-8 T T 0 C C 0
溶液，再次孵育 2 h 后，在 450 nm 波长处测溶液的 不同体积分数的样品水溶液/mL 1 1 — —
吸光度。按式(1)计算细胞存活率。 无水乙醇/mL 2 2 3 3
OD  OD DPPH 溶液/mL 1 — 1 —
细胞存活率 /%  实验组 空白组  100 （1）
OD 对照组  OD 空白组 无水乙醇/mL — 1 — 1
1.2.6 黄花菜发酵液抗炎功效测定 注：“—”为此步骤不加该溶剂。

1.2.6.1 HaCaT 细胞炎性因子 TNF-α、IL-6、COX-2 DPPH 自由基清除率/%=
表达量的测定 〔1–(T–T 0 )/(C–C 0 )〕×100 （2）
采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测 HaCaT 细 式中：T—样品管吸光值，即样品与 DPPH 反应后溶
胞炎性因子 TNF-α、IL-6、COX-2 的表达量（具体 液吸光值；T 0 —样品本底吸光值；C—DPPH 管吸光
方法见试剂盒说明书）。按照 1.2.4 节进行细胞培养， 值，即未加样品时 DPPH 溶液吸光值；C 0 —溶剂本
4
计数 HaCaT 细胞，以 1×10 个/孔加入 96 孔培养板中。 底吸光值。所得结果以（平均值±标准差）表示，讨
在细胞培养箱中培养 12 h，弃培养基后加入 1 mL 论部分均使用平均值。
2
PBS，再用 UVB（照射剂量为 19.18 mJ/cm ，照射 1.2.7.2 羟基自由基清除实验 [11]
时间为 15 s）照射细胞，吸出 PBS，加入用无血清 将 0.5 mL 浓度为 0.75 mol/L 邻二氮菲无水乙醇