Page 156 - 《精细化工》2023年第5期
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·1076·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

            溶液倒入试管中，依次加入 1 mL  浓度为 0.15 mol/L                      将对数生长期间的 B16 细胞，接种于 96 孔细
            PBS 和 0.5 mL 蒸馏水，摇匀后再加入 0.5 mL  浓度                 胞培养板，在 37  ℃，体积分数 5% CO 2 培养箱中培
            为 0.75 mmol/L  硫酸亚铁和 0.5 mL  体积分数 0.01%            养过夜。加入用 DMEM 稀释成体积分数为 2.5%的
            过氧化氢溶液，将试管置于 37  ℃水浴 60 min 后，在                    样品溶液。未加样品组为对照组，每组 3 个复孔。孵
            波长 536 nm 处测其吸光值，记为损伤管吸光度（A 损伤），                   化 48 h 后，弃上清液，用 PBS 清洗 1 次。在每个孔中
            未损伤管以 0.5 mL 蒸馏水代替损伤管中的 0.5 mL                     加入 100  μL 的细胞裂解液，用刮刀刮去细胞，1500
            体积分数 0.01%过氧化氢溶液，操作方法如上，所得                         r/min 离心上清液 10 min。将 50 μL 上清液倒入已含有
            数据记为 A 未损伤，样品管用去离子水稀释成不同体积
                                                               50 μL 体积分数 1%左旋多巴的 96 孔板中，并在体积
            分数的样品水溶液代替损伤管中的蒸馏水，可测得                             分数 5% CO 2 的培养箱中于 37  ℃培养 1 h，在 475 nm
            样品管中的吸光度，记为 A 样品，按式（3）计算样品
                                                               处测溶液的吸光度。按式（4）计算细胞反应体系下
            对羟基自由基的清除率。                                        酪氨酸酶的相对活性。
                                    A   – A
              羟基自由基清除率        / %   样品    损伤    100    （3）   A 细胞/%＝(OD 样品–OD 空白组)/(OD 对照组–OD 空白组)×100（4）
                                   A 未损伤  – A 损伤
            1.2.7.3   总抗氧化能力测定                                 式中：A 细胞为细胞反应体系下酪氨酸酶相对活性，%；
                                                               OD 样品为含有待测样反应体系的吸光度；OD 空白组为
                 参考文献 [12] 测定样 品的总抗 氧化能力
            （TEAC）。标准溶液的配制：将浓度为 10 mmol/L                      不含任何物质空板的吸光度；OD 对照组为不含待测样
                                                               反应体系的吸光度。
            的 Trolox 标准溶液用蒸馏水稀释成 0.15、0.3、0.6、
            0.9、1.2 和 1.5 mmol/L 的溶液。得到标准曲线方程                  1.2.9   黄花菜发酵液安全性功效测定
                                    2
            为：y= –0.584x+0.5288（R =0.9984）。                        通过鸡胚绒毛尿囊膜实验（HET-CAM）来评价
                 样品测定：在每个检测孔中加入 200 μL 2,2′-联                  黄花菜发酵液的安全性功效。
            氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）工                           将 300  μL 黄花菜发酵液直接渗透到绒毛膜
            作液。将 96 孔分为空白对照孔、标准溶液检测孔和                          （CAM）中 5 min，观察绒毛膜毒性参数（如出血、
            样品液检测孔。分别加入 10 μL 蒸馏水或 PBS、10 μL                   血凝、血管溶解等）的变化。每一受试物用 6 只鸡
            不同浓度 Trolox 标准溶液、10  μL 用去离子水稀释                    胚进行测试，采用终点评估法（ES）进行实验，根
            的体积分数为 2.5%的不同发酵液，轻轻混匀。孵育                          据血管出血现象进行评分，根据分数将其刺激性进
            2~6 min 后在 734 nm 处测溶液的吸光值。将样品所                    行分类，ES 评分范围见表 3。
            得的吸光值代入标准曲线方程后，得到其总抗氧化
            能力数值。                                                表 3  HET-CAM 终点评估法的眼刺激性预测模型
                                                               Table 3    Prediction model of eye irritation based on HET-
            1.2.7.4  Ⅰ型胶原蛋白含量测定                                       CAM endpoint assessment method
                 取体积分数为 2.5%的发酵液和水提液，经
                                                                       评分标准                  刺激性分类
            0.22 μm 无菌滤膜过滤后作用于 HaCaT 细胞 24 h，
                                                                      ES<6                  无刺激性
            收 集细胞 培养 液于无 菌离 心管中 ，于 4  ℃、
                                                                      6≤ES<12               轻度刺激性
            2500 r/min 下离心 20 min，保存上清液。使用Ⅰ型                          12≤ES<15              中度刺激性
            胶原蛋白（COL-Ⅰ）酶联免疫检测试剂盒进行检测。
                                                                      ES≥15                 重度刺激性
            1.2.7.5  CAT 含量测定
                 收集对数生长期状态良好的 HaCaT 细胞以                            受试物包括：阴性对照（体积分数 0.9%氯化钠水
                 6
            1×10 个细胞/孔密度铺于 96 孔板 12 h 后，弃细胞培                   溶液）、阳性对照（0.1 mol/L 氢氧化钠水溶液）和 3
            养基，选择体积分数为 2.5%的黄花菜水提液和发酵                          个样品（6 个平行）。对 CAM 进行形态学观察和打分。
            液为样品组，模型组和空白组加入无血清 DMEM，
            将其作用 HaCaT 细胞 24 h 后倒掉，PBS 清洗 2 遍，                 2   结果与讨论
            加入 250 μmol/L 的过氧化氢作用 2 h 后倒掉（空白                   2.1   黄花菜植物乳杆菌发酵液理化指标
            组不加过氧化氢作用），PBS 清洗 2 遍，置于冰上，
                                                                   黄花菜植物乳杆菌发酵液为浅棕红色黏稠液
            加入提前配制好的细胞裂解液 100 μL，待细胞完全
            裂解后，吸取板内裂解液，于 4  ℃、10000 r/min 条                   体，pH=4.4，黏度为 0.16 Pa·s，可溶性固含物质量
                                                               分数 1.7%，菌落总数小于 50 CFU/mL，无致病菌检
            件下离心 10 min，取上清液进行 CAT 含量测定，按
            照试剂盒说明书进行操作。                                       出。根据化妆品卫生标准 GB 7916—87，黄花菜植
            1.2.8   黄花菜发酵液美白功效测定                               物乳杆菌发酵液符合化妆品质量要求。
                 通过胞内酪氨酸酶活性抑制实验来评价黄花菜                          2.2    黄花菜酿酒酵母发酵液理化指标
            发酵液美白功效。                                               黄花菜酿酒酵母发酵液为淡粉色至棕红色黏稠
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