Page 149 - 《精细化工》2022年第11期
P. 149

第 11 期                 张喜峰，等:  两种方法提取琉璃苣叶多糖的理化性质及生理活性                                   ·2299·


            处理 3 d，30  ℃真空冷冻干燥 24 h 获得 2 种多糖（纤                 1.4.2   α-淀粉酶活性抑制实验
            维素酶辅助提取法和微波辅助提取法提取的多糖分                                 α-淀粉酶活性抑制作用参照文献[16]的方法略
            别记为 BLP-1、BLP-2），备用。                               作改动。简言之，将 100 μL α-淀粉酶（5 U/mL）溶
            1.3   多糖理化性质测定、结构表征和性能测试                           液和 50  μL 不同质量浓度多糖溶液（0.025、0.05、
            1.3.1   成分分析                                       0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 g/L）添加到 96 孔板
                 采用苯酚-硫酸比色法         [13] ，以 D-葡萄糖为标准           中。在 25  ℃孵育 10 min 后，添加 50 μL 质量分数
            品，在 490 nm 处测定糖含量。蛋白质含量在 595 nm                    为 1%的淀粉溶液并培养 10 min，加入 100 μL 质量
            处通过考马斯亮蓝 G-250 法         [14] 以牛血清白蛋白为标            浓度为 10 g/L 的 3,5-二硝基水杨酸终止反应，沸水
            准品进行比色测定。                                          浴 10 min 后，采用酶标仪在 540 nm 处测其吸光度，
            1.3.2   相对分子质量和单糖组成测定                              根据式（1）计算抑制率。
                 BLP-1 和 BLP-2 的均一性和相对分子质量通过                   1.4.3   抗肿瘤活性测定
            配备折射率检测器的高效凝胶渗透色谱仪（HPGPC）                          1.4.3.1   细胞培养
            进行检测，流动相为 0.02 mol/L 磷酸二氢钾，流速                          人肝癌细胞 HepG-2 和人肺腺癌细胞 A549 在
            为 0.8 mL/min。                                      DMEM 完全培养基（体积分数 10%胎牛血清+体积
                 准确称取 5 mg 多糖粉末，加入 2  mL 2 mol/L               分数 1%青霉素-链霉素+体积分数 89% DMEM 基本
            TFA 在 121  ℃加热水解 2 h，减压蒸干，加入 3 mL                  培养基）中培养，人乳腺癌细胞 MX-1 在 RPMI-1640
            甲醇蒸干，重复操作 2~3 次，以完全除去 TFA，去                        完全培养基（体积分数 10%胎牛血清+体积分数 1%
            离子水溶解后，采用液相色谱柱，进样量为 20 μL。                         青霉素-链霉素+体积分数 89% RPMI-1640 基本培养
            采用体积比 39∶1 的去离子水和 100 mmol/L NaOH                  基）中培养。所有细胞均在 37  ℃、体积分数为 5%
            水溶液洗脱 60 min，柱温为 30  ℃，利用电化学检                      的 CO 2 的培养箱中培养。
            测器对单糖组分进行分析检测。                                     1.4.3.2   抗癌能力测试
            1.3.3   结构表征和性能测试                                      将细胞密度为 2×10 细胞/孔的 96 孔培养板置
                                                                                    4
                 FTIR 测试：将干燥的多糖与 KBr 粉末混合并压                    于 37  ℃、体积分数为 5%的 CO 2 孵育箱中培养 6 h。
            制成 2 mm 厚的薄片进行 FTIR 测试，波数范围为                       通过亚甲基蓝比色法测定多糖对 HepG-2 细胞、
                         –1
            4000~500 cm 。SEM 测试：将冷冻干燥的样品放                      A549 细胞和 MX-1 细胞的抑制率          [17] 。在去除培养液
            置于导电胶样品处理片中，用吸耳球吹掉未黏着的                             后，用 100 μL 0.1 mol/L PBS 溶液（pH=6.8）清洗孔。
            样品，喷金后置于场发射环境扫描电子显微镜中观
                                                               然后分别添加不同质量浓度（300、500、700、900、
            察。TGA 测试：取 2~5 mg 冻干样品，采用热重分
                                                               1100 mg/L）的 BLP-1 和 BLP-2 多糖溶液培养 72 h
            析仪在 25~750 ℃下进行测试，N 2 作为加热介质，
                                                               后，取出培养液，用 100 μL 0.1 mol/L PBS 溶液清洗
            流速为 10 mL/min。
                                                               孔加入 50 μL 质量浓度 10 g/L 的亚甲基蓝染色液培
            1.4   体外降血糖活性
                                                               养 1 h，用清水冲洗，在 96 孔板中加入 100 μL 洗脱
            1.4.1   α-葡萄糖苷酶活性抑制实验
                                                               缓冲液（体积分数为 49% PBS 溶液+体积分数为 50%
                 α-葡萄糖苷酶活性抑制实验参照文献[15]的方
                                                               乙醇水溶液+体积分数 1%乙酸水溶液）。最后，在每
            法略作改动。将 96 μL 0.1 mol/L PBS 溶液（pH=6.8）、
                                                               个孔完全洗脱后，采用酶标仪在 570 nm 处测量每孔
            20 μL 酶活力为 2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和 10 μL
                                                               吸光度。阳性对照为 5-氟尿嘧啶（5-Fu）溶液（质
            不同质量浓度多糖（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、
                                                               量浓度为 400 mg/L），多糖对不同细胞抑制率按式
            0.8、1.6、3.2 g/L）的混合溶液加入 96 孔板中，在
                                                               （2）进行计算：
            37  ℃下培养 30 min；然后，添加 50 μL 10 mmol/L
                                                                                      A   
            对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷溶液，反应 90 min，通                                抑制率/%= 1      样品        100    （2）
            过添加 100 μL 1 mol/L 碳酸钠终止反应；最后，采                                           A 空白  
            用酶标仪在 405 nm 处测其吸光度。以阿卡波糖为阳                        式中：A样品为与多糖或 5-Fu 孵育的细胞溶液的吸光
            性对照，通过式（1）计算抑制率：                                   度；A空白为与培养基孵育的细胞溶液的吸光度。
                                  A  A                      1.4.4   免疫活性测定
                      抑制率/%= 1    1   X      100    （1）
                                    A 2                      1.4.4.1   多糖对巨噬细胞的毒性
            式中：A 1、A X 和 A 2 分别为样品组（多糖样品或含酶的                       小鼠巨噬细胞 RAW264.7 在 DMEM 完全培养基
            阳性对照）、对照组（不含酶的多糖样品或阳性对照）                           中置于 37  ℃、体积分数为 5% CO 2 培养箱培养 24 h，
                                                                                     5
            和空白组（仅适用于含酶的 PBS 溶液）的吸光度。                          96 孔板细胞密度为 1×10 细胞/孔。然后，以质量浓
   144   145   146   147   148   149   150   151   152   153   154